丹參酮ⅡA誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制

丹參酮ⅡA誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制

陳陽1趙秋宇宋囡賈連群

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽110847)

摘要〔〕目的探討中藥活性單體丹參酮ⅡA對人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。方法用5、10、20、30、40、50 μmol/L丹參酮ⅡA處理HepG2細(xì)胞，應(yīng)用MTT法分析細(xì)胞活力，MUSE細(xì)胞分析儀、PI染色等檢測細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期以及凋亡情況。免疫蛋白印跡技術(shù)檢測p53、Bax及Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果5～50 μmol/L丹參酮ⅡA顯著降低細(xì)胞存活率(P<0.01)，形態(tài)學(xué)觀察可見細(xì)胞凋亡改變，細(xì)胞發(fā)生G2/M期周期阻滯。免疫印跡結(jié)果顯示丹參酮ⅡA上調(diào)p53、Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)論丹參酮ⅡA對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用可能部分通過誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M周期阻滯和線粒體途徑凋亡實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞〔〕丹參酮ⅡA；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

中圖分類號〔〕R392.11〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年

通訊作者：賈連群(1975-)，女，副教授，博士后，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治肝病研究。

The mechanisms of apoptosis induced by TanshinoneⅡA in human hepatoma HepG2 cells

CHEN Yang, ZHAO Qiu-Yu, SONG Nan,etal.

Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847，Liaoning, China

Abstract【】ObjectiveTo examine the effects of tanshinoneⅡA on growth and apoptosis in HepG2 cells.MethodsHepG2 cells were treated with various concentrations of tanshinoneⅡA. Assays were performed to determine cell viability; cell cycle arrest, apoptosis and protein expression were measured by MTT, MUSE cytoanalyze, PI staining and Western blotting.ResultsAfter HepG2 cells were treated with different concentrations of tanshinoneⅡA ( 5～50 μmol/L) , the growth of HepG2 cells were significantly inhibited compared with those of control group(P<0.01), the HepG2 cells displayed typical morphological changes and induced G2/M-phase arrest of the cell cycle and apoptosis. TanshinoneⅡA increased expressions of p53 and Bax as well as caused down-regulation of Bcl-2 expression.ConclusionsTanshinoneⅡA could inhibit the growth of HepG2 cells via inducing G2/M arrest followed by the mitochondrial pathway of apoptosis.

【Key words】TanshinoneⅡA; HepG2 cells; Cell cycle; Apoptosis

1沈陽市第六人民醫(yī)院

第一作者：陳陽(1976-)，男，碩士，主要從事中藥護(hù)肝作用分子機(jī)制研究。

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge的干燥根及根莖，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最廣泛的藥物之一，其化學(xué)成分主要分為脂溶性和水溶性兩類。丹參酮ⅡA是丹參的脂溶性有效單體，具有抗氧化、抑制血小板聚集和抗凝血、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、擴(kuò)張冠狀動脈及抗炎、抗腫瘤等作用〔1〕。近年研究表明，丹參酮ⅡA對多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與抑制合成調(diào)節(jié)細(xì)胞周期影響凋亡和原癌基因的表達(dá)等有關(guān)〔2〕。本研究擬討論丹參酮ⅡA在體外對人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡作用及其機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料人肝癌HepG2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，體外培養(yǎng)傳代。丹參酮ⅡA購自中國藥品生物制品檢定所。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、硫酸鏈霉素、青霉素、0.25%胰酶購自美國Hyclone公司。MTT為美國Sigma分裝。p53、Bax、Bcl-2及β-actin抗體、二抗羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自碧云天公司。其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HepG2接種于10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、0.2% NaHCO3的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。

1.2.2MTT法測定細(xì)胞活性用0.25%胰蛋白酶消化取得對數(shù)生長期受試細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以5×104/ml的密度接種于96孔板中，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞充分貼壁后，除去培養(yǎng)液，分為空白對照組和給藥組。給藥組每孔加入用培養(yǎng)液配制的不同濃度的丹參酮ⅡA溶液(5、10、20、30、40、50 μmol/L)100 μl。對照組加入含0.1% DMSO的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)12、24、48 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入15 mg/ml MTT 工作液20 μl，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min以充分溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光度值(A)，按下列公式計算給藥物后腫瘤細(xì)胞的存活率，計算半數(shù)(IC50)。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率:抑制率(%)=〔A490( 陰性對照) -A490(丹參酮ⅡA)〕/A490( 陰性對照)×100%。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察將HepG2細(xì)胞以每孔1×105個/ml密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h后，對照孔僅加入新鮮的含10% FBS培養(yǎng)液，給藥孔分別加入20、30、40 μmol/L丹參酮ⅡA，作用24 h后，置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.4檢測HepG2細(xì)胞周期HepG2細(xì)胞4瓶(25 cm2培養(yǎng)瓶)，細(xì)胞同步化24 h后棄舊饑餓液，給藥組20、30、40 μmol/L丹參酮ⅡA 4 ml，作用24 h，每瓶細(xì)胞分別消化后，用1 ml PBS重懸于1.5 ml EP管中，1 000 r/min離心5 min，先分別加入150 μl PBS再次重懸，緩慢加入350 μl無水乙醇進(jìn)行細(xì)胞固定，4℃過夜，次日，PBS洗2次后，加入200 μl的周期試劑重懸細(xì)胞，避光孵育30 min，Muse細(xì)胞分析儀檢測。

1.2.5檢測HepG2細(xì)胞凋亡細(xì)胞消化后，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液1 ml重懸細(xì)胞于1.5 ml EP管中，再分別從上述各管中取出100 μl，然后每100 μl細(xì)胞中均加入100 μl細(xì)胞凋亡檢測試劑，室溫孵育20 min，Muse細(xì)胞分析儀檢測。

1.2.6碘化丙啶(PI)染色將HepG2細(xì)胞以每孔1×105個/ml密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h后，對照孔加入完全培養(yǎng)液(10%FBS)，給藥組加丹參酮ⅡA作用24 h。向細(xì)胞中加入1 ml PI染液，4℃避光染色30 min后，熒光顯微鏡觀察被染色細(xì)胞核數(shù)量的改變。

1.2.7Western印跡法檢測蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Bio-Rad法定量蛋白，取40 μg總蛋白上樣，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉3～ 4 h，與抗p53、Bax、Bcl-2的抗體4 ℃孵育過夜，用含有0.1%Tween-20的TBST漂洗PVDF膜，3×5 min。二抗37 ℃水浴搖床溫孵2 h。TBST漂洗3×5 min。按試劑盒說明書混合發(fā)光液A和B，與膜作用5 min后進(jìn)行X光片曝光。X光片顯影和定影后觀察結(jié)果。

2結(jié)果

2.1丹參酮ⅡA對人肝癌HepG2細(xì)胞的生長抑制作用MTT結(jié)果表明，5～50 μmol/L的丹參酮ⅡA對HepG2細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，并呈現(xiàn)出較好的量效和時效關(guān)系，隨著藥物處理時間延長和作用濃度加大，其生長抑制作用逐漸增強(qiáng)。12 h的理論IC50是50.65 μmol/L，24 h是32.17 μmol/L，48 h為 14.17 μmol/L。見圖1。

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01 圖1　各組HepG2細(xì)胞生長抑制情況

2.2丹參酮ⅡA誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化對照組細(xì)胞的細(xì)胞核形狀規(guī)則，染色質(zhì)均一，而丹參酮ⅡA處理組細(xì)胞的細(xì)胞核形狀發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、斷裂、邊緣化等明顯的凋亡改變。見圖2。

2.3丹參酮ⅡA 對HepG2細(xì)胞G2/M期影響的量效關(guān)系20、30、40 μmol/L丹參酮ⅡA 處理HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞處于G2/M期的數(shù)目明顯增多，而處于G0/G1期和S期的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，HepG2細(xì)胞生長阻滯于G2/M期。隨著作用濃度的增加，G2/M期的比例都有所升高，呈現(xiàn)出較一定的劑量依賴性。見圖3。

2.4丹參酮ⅡA 對HepG2細(xì)胞凋亡影響的量效關(guān)系丹參酮ⅡA(0、20、30及40 μmol/L)作用于HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞早期凋亡率分別為1.13%、8.11%、8.91%和10.84%。隨著藥物濃度的提高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。

圖2　不同濃度丹參酮ⅡA作用24 h后 HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×200)

圖3　不同濃度丹參酮ⅡA處理24 h誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞發(fā)生G 2/M期周期阻滯

2.5PI染色與對照組相比，丹參酮ⅡA處理過的HepG2細(xì)胞核紅染明顯增加，且有劑量依賴性。見圖4。

圖4　PI染色丹參酮ⅡA 處理24 h的HepG2細(xì)胞

2.6丹參酮ⅡA 對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響不同濃度丹參酮ⅡA處理24 h的HepG2細(xì)胞與對照組比較，p53和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。見圖5。

圖5　不同濃度丹參酮ⅡA 處理HepG2細(xì)胞24 h后， p53、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的變化

3討論

目前，肝癌的治療方法以手術(shù)、放療和化療為主，但這些方法大部分毒副作用較大，因此，新型高效低毒抗癌藥物的研制開發(fā)已經(jīng)成為優(yōu)化腫瘤治療策略以及最終攻克癌癥的希望〔2〕。丹參酮為丹參的乙醚或乙醇提取物，是丹參的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理和臨床實(shí)踐證明丹參酮具有保護(hù)心肌、擴(kuò)張冠脈、改善心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、抗血栓形成、改善微循環(huán)、抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤等多種藥理作用。丹參酮ⅡA是丹參重要的脂溶性成分之一，在白血病、肝癌、肺癌等的治療中已得到應(yīng)用〔3，4〕。

細(xì)胞周期中的G1/S、S、G2、G2/M幾個檢測點(diǎn)在調(diào)控細(xì)胞周期有序進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。與正常細(xì)胞不同的是，多數(shù)腫瘤細(xì)胞往往缺失G1/S檢測點(diǎn)，所以腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞增殖更加旺盛。由于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的這種差別，G2/M檢測點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞中尤為重要，并已經(jīng)成為選擇性高和安全性好的腫瘤藥物治療的新靶點(diǎn)。丹參酮ⅡA能使HepG2細(xì)胞周期阻滯在G2/M檢測點(diǎn)，并最終誘導(dǎo)凋亡。

p53是細(xì)胞應(yīng)激的關(guān)鍵性調(diào)控分子之一，通過轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄途徑對細(xì)胞危急事件信號做出包括細(xì)胞生長抑制或凋亡在內(nèi)的不同反應(yīng)，同時可調(diào)控多種基因表達(dá)，對細(xì)胞增殖分化具有重要影響〔5〕。本研究中各濃度組p53蛋白高水平表達(dá)可能與丹參酮ⅡA導(dǎo)致的DNA損傷有關(guān)。P53蛋白是轉(zhuǎn)錄激活因子，在DNA損傷后其穩(wěn)定性增加而得到激活，轉(zhuǎn)而去調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。在正常條件下，p53是一個極不穩(wěn)定的蛋白，與DNA的結(jié)合能力也相對較低。而在DNA損傷后，有一系列的蛋白翻譯后加工生化修飾過程，可增強(qiáng)p53蛋白的穩(wěn)定性，并激活其與特異序列的結(jié)合活性，因而DNA損傷后伴有細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平升高〔6〕。

Bcl-2家族蛋白在線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用〔7〕。Bcl-2蛋白可穩(wěn)定線粒體膜的通透性，抑制細(xì)胞色素c釋放和caspase-9活化。Bax與線粒體膜上的孔蛋白相互作用，使線粒體膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)、caspase-9活化及效應(yīng)caspase激活，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8〕。丹參酮ⅡA作用HepG2細(xì)胞后，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)。文獻(xiàn)報道，上游調(diào)控分子可調(diào)節(jié)Bcl-2和(或)Bax蛋白表達(dá)，如p53通過上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)Bcl-2與Bax的分子比率〔9，10〕。

綜上所述，丹參酮ⅡA通過誘導(dǎo)G2/M周期阻滯和細(xì)胞凋亡抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，為丹參酮ⅡA開發(fā)為潛在的抗癌藥物提供了理論依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

1賈連群，馮峻屹，楊關(guān)林，等.丹參酮ⅡA對EA.hy926細(xì)胞TLR4/NF-κB炎癥信號通路的影響〔J〕.中國生化藥物雜志，2011；32(5)：337-40.

2袁春意，謝瓊.丹參酮ⅡA在腫瘤領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展〔J〕.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009；15(9)：67-9.

3Jia LQ,Yang GL,Ren L,etal.TanshinoneⅡA reduces apoptosis induced by hydrogen peroxide in the human endothelium-derived EA.hy926 cells〔J〕.J Ethnopharmacol,2012;143(1):100-8.

4宋囡，何文智，王智民，等.左、右歸丸及其拆方對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化后細(xì)胞周期和凋亡的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2013；28(5)：1520-4.

5褚啟龍，哈建利，夏濤，等.氟對人胚肝細(xì)胞DNA損傷及p53蛋白表達(dá)影響〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2011；27(9)：1154-5.

6Brito AF,Abrantes AM,Pinto-Costa C,etal.Hepatocellular carcinoma and chemotherapy:the role of p53〔J〕.Chemotherapy,2012;58(5):381-6.

7Zou H,Li Y,Liu X,etal.An APAF-1 cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9〔J〕.J Biol Chem,1999;274(17):11549-56.

8Zhou J,Zhang S,Ong CN,etal.Critical role of pro-apoptotic Bcl-2 family members in andrographolide-induced apoptosis in human cancer cells〔J〕.Biochem Pharmacol,2006;72(2):132-44.

9董雅潔，高維娟.bcl-2、bax、caspase-3在細(xì)胞凋亡中的作用及其關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；11(32)：4828-30.

10Reed JC.Bcl-2 family proteins:regulators of apoptosis and chemoresistance in hematologic malignancies〔J〕.Semin Hematol,1997;34(4 Suppl 5):9-19.

〔2012-10-10修回〕

(編輯徐杰)