雙濾膜過(guò)濾方法在藥品微生物限度檢查中的應(yīng)用分析

陳國(guó)強(qiáng)

【摘要】目的：驗(yàn)證雙濾膜過(guò)濾方法消除供試液抑菌活性的有效性，探討藥品微生物限度檢查中建立雙濾膜過(guò)濾方法的可行性。方法：將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌作為挑戰(zhàn)菌，以培養(yǎng)基稀釋法和離心沉淀法作為對(duì)照方法，雙濾膜過(guò)濾方法作為實(shí)驗(yàn)組，考察雙濾膜過(guò)濾法的精密度、準(zhǔn)確度、定量限等。結(jié)果：利用雙濾膜過(guò)濾法在準(zhǔn)確度、精密度、定量限等檢測(cè)方面的結(jié)果優(yōu)于或與現(xiàn)行的中國(guó)藥典收載的方法持平。結(jié)論：利用雙濾膜過(guò)濾方法處理供試品的過(guò)程符合中國(guó)藥典微生物限度檢查法的相關(guān)規(guī)定，結(jié)果有效，雙濾膜過(guò)濾方法可以用于藥品微生物限度檢查。

【關(guān)鍵詞】雙濾膜過(guò)濾法；藥品；微生物限度檢查

【中圖分類號(hào)】R-1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1671-8801（2015）01-0337-02

在藥品微生物限度檢查中，片劑、栓劑以及膏劑等供試液中會(huì)含有不溶性殘?jiān)约案郊觿┑龋苯永帽∧み^(guò)濾法會(huì)造成濾膜堵塞問(wèn)題[1]。而采用離心取上清液的方法，雖然能解決以上問(wèn)題，然而，此法影響了微生物的回收率，較易造成數(shù)據(jù)結(jié)果的失真。雙濾膜過(guò)濾方法能夠有效地解決上述問(wèn)題，下文就對(duì)該法在藥品微生物限度檢查中的應(yīng)用進(jìn)行分析。

1.一般資料

將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌作為挑戰(zhàn)菌，以山東三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的復(fù)方丹參片作為供試品，同時(shí)提供玫瑰紅鈉瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂以及膽鹽乳糖三種培養(yǎng)基，采用YT—X303型微生物限度檢查儀進(jìn)行檢測(cè)。雙濾膜中A膜孔徑20～30μm，直徑85mm，B濾膜孔徑≤0.45μm，直徑0.75mm。將復(fù)方丹參片作為研究對(duì)象，雙濾膜過(guò)濾方法作為實(shí)驗(yàn)組，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證采用培養(yǎng)基稀釋法作為對(duì)照，細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證采用離心沉淀法加薄膜過(guò)濾法作為對(duì)照。取10g復(fù)方丹參片，加100ml的pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液，攪拌均勻，將其作為1：10的供試液。取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌，按藥典收載的方法制成103～104cfu·mL-1的孢子懸液或者菌懸液。每種挑戰(zhàn)菌制備10個(gè)菌濃度，測(cè)定方法為平皿法。

2.方法與結(jié)果

2.1準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

2.1.1準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)方法

取1000mL的1：10供試液，均等分成10組，對(duì)應(yīng)的加入10種濃度的實(shí)驗(yàn)菌各1mL，將其充分混勻。將供試液中黑曲霉的最終均濃度控制在0～100cfu·mL-1，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念球菌的最終菌濃度控制在0～300cfu·mL-1。

實(shí)驗(yàn)組利用雙濾膜過(guò)濾法：取1mL上述已接種實(shí)驗(yàn)菌的供試液，用100mL的稀釋液進(jìn)行稀釋，用100mL的沖洗液沖洗A濾膜，取下A濾膜，再用100mL的沖洗液沖洗B濾膜，取下B濾膜接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

對(duì)照組根據(jù)菌的種類采用不同的培養(yǎng)方法。

培養(yǎng)基稀釋法：用作酵母菌和霉菌對(duì)照。取2mL上述已接種試驗(yàn)菌的供試液，每1mL供試液均等地注入5個(gè)平皿中，按照藥典收載的方法進(jìn)行培養(yǎng)。

離心沉淀聯(lián)合薄膜過(guò)濾法：用作細(xì)菌對(duì)照。取10mL上述已接種試驗(yàn)菌的供試液，用500r·min-1的速度離心3min，取上清液，按照薄膜過(guò)濾法進(jìn)行操作。

2.1..2準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)每種挑戰(zhàn)菌在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的菌液濃度差異。結(jié)果：枯草芽孢桿菌10組平均回收率為93%，對(duì)照組分別為63%；實(shí)驗(yàn)組雙濾膜過(guò)濾法實(shí)驗(yàn)菌回收率高于對(duì)照組離心沉淀聯(lián)合薄膜過(guò)濾法，差異顯著P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組對(duì)霉菌的回收率與對(duì)照組之間的差異不明顯，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2精密度實(shí)驗(yàn)

2.2.1精密度實(shí)驗(yàn)方法

利用上述5種實(shí)驗(yàn)菌，按照準(zhǔn)確度的操作方法，對(duì)每個(gè)濃度的菌懸液進(jìn)行10次的重復(fù)測(cè)量，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2.2精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果表明，精密度方面，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異不顯著，P>0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雙濾膜過(guò)濾法與培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀聯(lián)合薄膜過(guò)濾法在精密度方面的差異不明顯。

2.3定量限實(shí)驗(yàn)

2.3.1定量限實(shí)驗(yàn)方法

取4000mL的1：10供試液，均勻分成40組，將大腸埃希菌作為實(shí)驗(yàn)菌，向40組供試液中加入1mL不同濃度的大腸埃希菌，為使微生物均勻分散，充分震蕩試管。最終的供試液菌濃度≤10cfu·mL-1，分別利用雙濾膜過(guò)濾法和離心沉淀聯(lián)合薄膜過(guò)濾法處理供試液，將其作為c組；雙濾膜過(guò)濾法實(shí)驗(yàn)組，隨機(jī)抽取15個(gè)樣本，作為a組，將A、B濾膜接種到100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中；隨機(jī)抽取25個(gè)樣本，作為b組，只將B濾膜接種到100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。利用分割法分析a、b、c三組的檢驗(yàn)結(jié)構(gòu)是否存在差異。

2.3.2定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，a、b組之間無(wú)差別，說(shuō)明A濾膜不會(huì)對(duì)雙濾膜過(guò)濾法的定量限造成顯著性的影響；c組和a、b兩組之間的差異性顯著，說(shuō)明雙濾膜過(guò)濾法定量限高于離心沉淀聯(lián)合薄膜過(guò)濾法。

3.討論

雙濾膜過(guò)濾法中的使用的A濾膜，當(dāng)用于真菌過(guò)濾時(shí)，其孔徑要應(yīng)該大于30μm，用于細(xì)菌過(guò)濾時(shí)，其孔徑應(yīng)大于20μm[2]。對(duì)于較為粘稠的供試液，使用雙濾膜過(guò)濾法時(shí)，應(yīng)采用少量多次的方式，有利于避免A濾膜發(fā)生堵塞[3]。本研究雙濾膜過(guò)濾法使用的B濾膜的直徑為75mm，高于藥典建議的50mm，因此，單張濾膜微生物的承載量較大。

本實(shí)驗(yàn)表明，采用雙濾膜過(guò)濾方法處理供試品，準(zhǔn)確度、精密度以及定量限等方面的檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于或與現(xiàn)行藥典收載的實(shí)驗(yàn)方法相持平。

綜上所述，利用雙濾膜過(guò)濾方法處理供試品的過(guò)程符合中國(guó)藥典微生物限度檢查法的相關(guān)規(guī)定，結(jié)果有效，雙濾膜過(guò)濾方法可以用于藥品微生物限度檢查。

參考文獻(xiàn)：

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