呼吸道九聯檢試劑在兒童呼吸道感染病原體檢測中的臨床意義探討

王洪建

(濮陽市人民醫院血液病研究所 河南濮陽 457000)

兒童呼吸道病毒感染是兒科患者中最常見的疾病，發病急、感染重，兒童多不能自述。為指導臨床合理用藥，需要一種快速簡便準確的試驗方法進行診斷［1］。本次研究針對以上特點，希望找到一種臨床可快速診斷的簡易方法，更好服務于患者與臨床。

1 對象與方法

1．1 研究對象 選取2014年1月至2014年7月在濮陽市人民醫院兒科病區住院的1 516例呼吸道感染兒童患者，其中男性682例，女性834例，年齡3個月～13歲，平均(2.5±0.3)歲。

1．2 檢測試劑 九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑為西班牙VIRCELL公司進口產品，購自鄭州安圖生物科技有限公司。

1．3 檢測方法

1．3．1 標本處理 采集患者空腹靜脈血2.0 ml，分別取15μl血清和15μl PBS液加入1.5 ml塑料安瓿管中，震蕩充分混勻。用抗人球蛋白IgG吸附劑150μl加入30μl混合液中，徹底混勻，處理后的血清3 000 r/min離心15 min，除去沉淀。

1．3．2 操作過程 在載玻片的九孔中每孔加15μl吸附劑處理過的血清標本。在1個載玻片加入15μl陽性對照，另1個加15μl陰性對照。將載玻片放濕盒37℃溫育1 h以上。用PBS洗液緩慢來回沖洗3次以上，避免直接對標本孔沖洗，然后浸泡在足量PBS液中放置搖床輕搖10 min。取出用蒸餾水緩慢水流沖洗。載玻片自然風干后每孔加入15μl FITC結合物溶液，將載玻片放入濕盒，37℃溫育30 min。取出載玻片，用PBS洗液緩慢流水沖洗，然后浸泡在PBS中并放置在水平搖床上輕輕搖動10 min，自然風干，加適量封片介質，小心蓋上載玻片。最后用熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司的CX22熒光顯微鏡)在400倍放大率下觀察結果。

1．3．3 結果判斷 陽性結果:可以觀察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒的整個包被孔中有3%～15%細胞的細胞核、胞漿或胞膜出現蘋果綠色熒光(在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時觀察到著色的合胞);軍團菌、衣原體或立克次體中所有的菌體呈現出蘋果綠色熒光;支原體出現細胞外圍蘋果綠色熒光。陰性結果:可觀察到軍團菌、肺炎支原體和立克次體無熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細胞呈現紅色。

1．3．4 注意事項 嚴格按照實驗操作說明書操作，PBS洗液需要事先配置，搖勻直至充分溶解，配好后儲存2～8℃備用，2 d內用完，有沉淀棄去重配。觀察結果要快速，需要有專人審核復檢，以免誤判誤認，結合操作手冊，建立本實驗室的判斷標準。

2 結果

2．1 各種病原體陽性感染率 在1 516例兒童呼吸道感染患者中，總陽性率為35.5%(537/1 516)。各種病原體中陽性率最高為肺炎支原體，占21.2%(321/1 516)，其次為腺病毒6.5%(99/1 516)，呼吸道合胞病毒 4.5%(68/1 516)，副流感病毒 3.3%(50/1 516)。

2．2 混合感染 片中可見2種以上病毒混合感染，多為肺炎支原體合并乙型流感病毒及肺炎支原體合并副流感病毒。混合感染率可達12.8%(194/1 516)，在陽性病例中占36.1%(194/537)。

3 討論

兒童呼吸道感染屬于兒科常見多發疾病，由于兒童年齡小，免疫力相對低下，起病急，尤其1歲以下兒童不能自述體征，往往伴隨高熱、抽搐癥狀，有一定病死率，嚴重威脅兒童健康。本調查結果中，肺炎支原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒是濮陽地區急性呼吸道感染的主要病毒病原體，并且有相當數量的患兒合并2種病毒混合感染，然而不同地區、不同人群可能是不同的。隨著近幾年病毒學的發展，國內認為各種病毒的總發病數有增多趨勢。因此，明確病原體是有效治療小兒肺炎的首要問題，但小兒肺炎的病原譜非常復雜。國外對小兒肺炎的病原體及臨床流行病學的研究資料較多，發達國家主要以病毒為主，其中以呼吸道合胞病毒占首位，細菌性肺炎以肺炎鏈球菌為主。我國對小兒肺炎病原學做系統研究較少，小兒肺炎在臨床上表現輕重不一。因此，病原學檢查非常重要，有利于早期診斷。研究顯示，瀘州地區以呼吸道合胞病毒為主［2］。濮陽市人民醫院收治病例以肺炎支原體感染為主，呼吸道合胞為第3位，與各地報道的呼吸道病毒檢出率不盡相同，所以各地檢驗工作者應探索建立本地呼吸道病毒流行譜，熟悉當地兒童呼吸道疾病流行狀態［3］。

本次九項呼吸道病原體檢測均為IgM，兒童呼吸道感染后首先出現IgM抗體，通常認為在病毒感染1周后出現，7～14 d達到高峰，表明有近期感染，在血清持續時間較短，一般為1～3個月，因此IgM是近期感染的有效標志物。采用間接免疫熒光法檢測呼吸道病毒特異性IgM，可以提供呼吸道病毒感染血清學證據，分析呼吸道病毒的流行病學特點，幫助指導臨床合理用藥［4］。本研究從抽取患者靜脈血到得出檢查結果共需要大約3 h，時間短，出結果較快，基本能夠為臨床提供比較及時的檢驗結果，滿足了臨床需求。

濮陽市人民醫院兒科為醫院重點學科，兒科普通病區與兒科重癥監護室開放床位400余張，每年冬春季床位仍供不應求，臨床對兒童呼吸道病毒的快速檢測有迫切要求，細菌培養雖然為細菌感染診斷金標準，但其有需數十小時培養的基本需求，無法滿足兒科臨床快速診斷、快速治療的要求。如無病原學診斷結果，盲目用藥，容易造成誤診、誤治和濫用抗生素現象。近年來由于免疫技術的發展，如直接、間接免疫熒光法等標記技術，特別是九聯檢試劑，檢測方便快速，符合臨床要求，使病原學快速診斷成為可能，在臨床診斷上有重要意義［5－6］。

九聯檢試劑雖然可以同時檢測九項病毒，但是兒童呼吸道感染病毒并不能全部檢測，還需要多種檢驗技術的配合應用，才能作出更加合理的診斷，并且該試驗必須同時檢測九種病毒，醫生不能面對患者癥狀分析并單獨開具某種病毒檢測，客觀上相對增加了患者的負擔，需要在這方面適當改進，使這種試劑技術更好地服務于臨床，服務于患者。

［1］ 秦茵茵，吳國鋒，秦笙，等．九項呼吸道聯檢試劑對多種呼吸道感染病原體檢測的臨床意義［J］．中華生物醫學工程雜志，2012，18(2):124－127．

［2］ 劉春艷，李程．2011年瀘州地區小兒肺炎感染病原學調查［J］．中國醫藥導報，2013，10(9):97 －99．

［3］ 董玉琳．呼吸道病原體九聯檢在小兒急性呼吸道疾病中的應用［J］．中外醫療，2012，31(33):170，172．

［4］ 王加芬，王鳳秀，鄭媛媛，等．呼吸道病毒特異性IgM檢測對兒童呼吸道感染的指導意義［J］．中國免疫學雜志，2015，(2):257 －260．

［5］ Ray CG，Minnich L L．Efficiency of immunofluorescence for rapid detection of Common respiratory viryses［J］．JClin Microbiol，1987，25:355－357．

［6］ 黃秋琳，許翔，江淑芳，等．直接免疫熒光法對多種呼吸道病毒檢測的臨床意義［J］．檢驗醫學與臨床，2008，5(3):135 －136．