HBV基因突變與肝細胞癌發生關系研究進展

粘學淵，許智慧，劉 妍，徐東平

·專題綜述·

HBV基因突變與肝細胞癌發生關系研究進展

粘學淵，許智慧，劉 妍，徐東平

HBV感染是引起肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）發生的主要因素，超過50％的HCC發生與HBV感染有關，因此HBV防治成為全球醫療熱點問題。HBV包含4個開放閱讀框（preS/S、preC/C、P、X），它們中的各種點突變、缺失、插入及截短突變與HCC發生相關。一些突變和乙型肝炎重癥化有關，可作為預測HCC發生的生物學指標；一些突變產生的特定HBV抗原直接或間接調節細胞周期及細胞凋亡等相關蛋白分子，促進細胞增殖及染色體不穩定，增加HCC發生風險。

乙型肝炎病毒；癌，肝細胞；突變

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）在男性常見的腫瘤中排第5位，占男性所有腫瘤的7.5％；在女性中排第9位，占女性所有腫瘤的3.4％。在世界范圍內HCC是導致死亡的第二大常見腫瘤，僅2012年就有746 000例死于HCC[1]。據統計我國大陸地區新發HCC和死于HCC患者數均占全球總數約50％[2]。目前已經證實HBV感染是引起HCC發生的主要因素，基因突變、病毒整合和宿主的易感性都被認為是導致HBV相關HCC發生的危險因素[3]。HBV復制過程中聚合酶缺乏校對功能，導致病毒具有高度變異性。HBV基因4個部分重疊開放閱讀框（preS/S、P、preC/C、X）發生的各種點突變、缺失、插入、截短突變與HCC發生密切相關[4]。針對HBV基因突變與HCC之間的關系，近幾年國內外學者做了大量研究。本文系統總結相關文獻，旨在討論HBV基因突變在預測HCC發生及致癌過程中的相關機制。

1preS/S基因突變與HCC的關系

S讀碼區分為preS1基因、preS2基因和S基因，表達大、中、小3種蛋白。大蛋白的起始密碼子位于preS1基因，中、小蛋白的起始密碼子位于S2基因，三者共用同一終止密碼子。大、小蛋白的功能是形成HBV外殼，中蛋白能夠增強病毒的分泌能力。近年來不斷深入的研究發現，preS基因的缺失突變能導致病毒的感染性、分泌能力、免疫原性及抗原抗體結合能力發生改變，這些都被認為會導致疾病進展，并最終發展為HCC的潛在機制。

S基因突變與HCC發生的相關區域位于preS區，目前亞洲地區已有大量文獻報道HBV preS缺失突變與HCC發生相關，Wang等[5]對亞洲地區17項關于preS缺失突變與HCC發生關系的病例對照研究進行薈萃分析，結果表明乙型肝炎（乙肝）患者HBV基因preS缺失突變，發生HCC的風險增高3.9倍。進一步分析我國大陸地區preS缺失變異情況，發生HCC的風險增高4.84倍，說明我國大陸地區HBV preS缺失后發生HCC的風險更高。我國一項研究發現HBV preS缺失和preS2起始密碼子突變與HCC發生相關，多變量分析顯示preS缺失和preS2起始密碼子突變導致HCC發生風險分別增高2.434和3.065倍。進一步縱向研究發現，在HBV感染初始階段preS缺失突變沒有被發現，隨著疾病的進展preS缺失突變率增高[6]。該課題組的前期研究也揭示了在慢性HBV感染者中，隨著疾病進展HBV preS基因缺失發生率呈上升趨勢，preS2基因缺失突變率在HCC患者中顯著增高，preS2基因缺失可能參與驅動HBV慢性感染的疾病進展[7]。然而，有研究發現在兒童階段HBV preS缺失突變就可發生，兒童發生HCC與HBV preS缺失突變顯著相關[8-9]。在兒童HCC患者的血清中，有近一半檢測到HBV preS2缺失突變；而兒童慢性乙肝患者的血清中，并未發現preS2缺失突變[8]。另一項對兒童HCC患者肝組織的研究發現，80％患者有HBV preS2缺失變異[9]。提示preS缺失突變在早期年齡階段就可發生，與兒童HCC發生相關。

近年國內外學者就HBV preS缺失突變導致HCC做了大量分子機制方面的研究。值得注意的是，preS2缺失突變抗原作為基因反式激活因子和內質網壓力的誘導物，可導致染色體不穩定[10-11]。過往研究表明，preS2突變抗原作為基因反式激活因子，上調細胞周期蛋白A，抑制細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白依賴激活酶4，誘導轉基因小鼠肝臟呈結節狀生長[10]。近年一項研究發現HBV preS2突變抗原在內質網內聚集，導致內質網壓力增大，此過程能夠誘導異常細胞周期蛋白A的表達以及細胞中心體過度合成，導致染色體不穩定，可能是HBV致HCC發生的一個潛在機制[11]。另一項研究納入韓國241例乙肝相關疾病患者，發現F241L突變與HCC顯著相關。進一步的細胞功能學研究發現F141L-HBV表面大蛋白（hepatitis B virus large surface protein,LHBs）能夠通過下調p53、p21途徑，以及上調細胞周期蛋白依賴性激酶4和細胞周期蛋白A導致細胞周期縮短。在集落形成實驗中發現，表達F141L-LHBs細胞的集落形成速率是野生型細胞的2倍。因此，F141L-LHBs可能通過誘導細胞的增殖導致HCC發生[12]。

2P基因突變與HCC的關系

HBV P基因開放閱讀框編碼聚合酶，P基因突變與核苷（酸）類似物耐藥相關。盡管P基因不如其他基因與HCC發生密切相關，但是抗病毒治療產生的耐藥突變會導致疾病進展。近年抗病毒耐藥后是否增大HCC發生風險，以及HBV核苷（酸）類似物相關耐藥基因與發生HCC關系成為研究熱點。

有研究表明，自然條件下發生的HBV RT基因點突變A799G、A987G和T1055A是HCC發生的獨立危險因素。縱向研究發現這些突變在HCC發生前4、5年就能檢測到，可能與HCC發生相關[13]。一項失代償期肝硬化患者前瞻性隊列研究發現，耐藥患者（30.6％）比完全病毒學應答患者（4.3％）2年HCC累積發病率顯著提高，且在耐藥發生后補救治療失敗患者中發生HCC的概率為55.6％。HBV DNA測序發現，rtA181T突變與耐藥拯救治療失敗密切相關，間接表明rtA181T耐藥突變可能與HCC發生相關[14]。另一項對拉米夫定（LAM）耐藥的123例慢性乙肝患者研究發現，HBV rtA181T/sW172*提前終止突變增加了耐LAM慢性乙肝患者發生HCC的風險[15]。進一步的功能學研究揭示rtA181T/ sW172*突變導致分泌的病毒顆粒有缺陷，引起細胞內HBsAg滯留，與野生型病毒共存時，對病毒體而非病毒亞單位分泌產生顯著負性影響，這都可能與致癌性相關[16]。

3CP/preC/C基因突變與HCC的關系

HBV核心啟動子位于基因組nt1613～nt1849，與X基因開放閱讀框的3′-端和preC基因5′-端重疊，由上游調控區（upper regulatory region,URR）（nt1613～nt1742）和基本核心啟動子區（basal core promoter,BCP）（nt1742～nt1849）組成。核心啟動子區對HBV的復制和轉錄起著重要的作用，它調控著preC/C RNA和pgRNA的合成。preC/C RNA是HBeAg前體合成的模板。pgRNA經翻譯生成HBcAg，也是HBV反轉錄、聚合酶合成的模板。核心啟動子區及preC區突變與HCC發生的相關性已被大量報道[4，17]。

Li等[18]發現HBV核心啟動子URR G1613A突變在HCC患者中更加常見。深入的分子研究也發現重組調節因子X1作為反式激活劑與HBV負性調控區結合，并且與G1613A突變基因序列的結合比野生型更加緊密。功能學研究發現G1613A突變能夠有效提高核心啟動子活性并增加病毒載量，增大HCC發生風險。另一項研究發現HBV核心啟動子URR G1613A和C1653T雙突變在HCC患者中更加常見，且單獨的G1613A突變與未來HCC的發生有相關性[19]。BCP的熱點突變有T1753A/C、A1762T、G1764A、C1766T等，其中以A1762T/G1764A雙聯突變最為常見。一項研究表明A1762T/G1764A雙聯突變對HCC的發生必要，三聯突變發生HCC風險高，四聯突變風險性更高[20]，該結論與另一項研究一致[21]。但是Chu等[22]通過比較HBV BCP突變與有肝硬化基礎HCC和無肝硬化基礎HCC的關系，發現HBV BCP突變與肝硬化相關，與HCC發生無關。對HBV CP區突變與HCC發生關系的分子機制研究近幾年也有新發現。研究表明HBV CP區A1762T/G1764A┼T1753A┼T1768A聯合突變能降低p21水平，以及增加細胞周期蛋白E表達，也可通過上調S期激酶相關蛋白2降低p21表達量，加快細胞增殖。因此，HBV CP區聯合突變可能通過這種途徑導致HCC的發生[23]。另一項研究表明HBV CP區突變可通過活化轉錄因子E2F1以及下調細胞周期抑制物，增強S期激酶相關蛋白的表達，縮短細胞增殖周期，這可能是HBV CP區突變增大HCC發生風險的另一個潛在機制[24]。

HBV preC區最常見的突變是G1896A，該突變可使28位色氨酸（TGG）變為終止密碼（TAG），導致HBeAg合成提前終止。此外，preC區1862、1899位點變異導致所編碼氨基酸改變，使HBeAg前體不能被信號酶裂解，影響HBeAg分泌。一項研究發現preC G1899A突變與HBeAg陽性有肝硬化基礎患者發生HCC相關，而preC G1896A突變與HBeAg陰性無肝硬化基礎患者發生HCC相關[25]。HBV C區變異，尤其是主要組織相容性復合物Ⅱ類限制性T細胞表位區的變異被發現與基因C型慢性乙肝患者發生HCC顯著相關[26]。

4X基因突變與HCC的關系

HBV X基因開放閱讀框編碼X蛋白，盡管一些體外研究發現HBx對病毒復制是必要的，但HBx對于病毒復制的具體功能仍然沒有完全明確。X基因與基本核心啟動子區及增強子Ⅱ重疊，因此X基因突變有可能會影響病毒復制。先前轉基因動物實驗雖已表明HBx有致癌性[27]，但其具體機制目前仍不清楚。近幾年國內外學者圍繞HBx調節細胞增殖及凋亡通路導致HCC發生的機制做了一些新的研究。

已知活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）能夠損傷脂質蛋白及DNA，因此會轉變信號通路并影響基因表達、細胞粘附、細胞代謝及細胞凋亡等相關過程。Jung和Kim[28]研究發現HBx C末端區域對ROS合成及8-氧鳥嘌呤形成至關重要。HBx C末端區域能夠誘導ROS產生，增加機體氧化壓力導致線粒體DNA損傷，可能對HCC發生起重要作用，也間接說明HBx可能與HCC發生相關。C末端截短HBx，尤其是C末端截短24氨基酸HBx蛋白可通過氨基酸激酶信號途徑活化金屬蛋白酶10增強細胞的侵襲力和轉移，這可能是C末端截短HBx促進HCC發生的機制之一[29]。微小RNA（microRNA,miRNA）可能參與了HCC發生過程：一項研究發現截短HBx能夠降低一系列具有生長抑制功能miRNAs的表達，間接促進肝細胞增殖，提示HBV C末端截短HBx可能通過下調miRNA途徑誘導HCC發生[30]。另外，Lee等[31]從HBV攜帶者中分離出2種HBx，一種為在第31絲氨酸位點含有磷酸化的蛋白激酶B（HBx-S31），具有抗凋亡作用；另一種為不包含磷酸化的蛋白激酶B（HBx-L31），具有促凋亡作用。功能學研究發現HBx-S31促進腫瘤的生長，而HBx-L31抑制腫瘤的生長。已知缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor,HIF）-1a有助于HCC的發生和發展。研究證實不同突變HBx對HIF-1a功能產生不同影響，總體水平上突變HBx蛋白增強HIF-1a表達水平，可能間接促進HCC發生[32]。

HBx與pre-S2突變蛋白的共同表達具有更強致癌作用。體外研究發現共同表達HBx和pre-S2突變蛋白的肝細胞能夠增強血管內皮生長因子A、磷酸化蛋白激酶B-1/2/3、胞外信號調節激酶1/2及雷帕霉素哺乳動物靶點。動物實驗發現含有HBx及pre-S突變質粒的轉基因小鼠平均15.1個月發展到HCC，比僅含有HBx突變蛋白轉基因小鼠（16.9個月）和僅含有pre-S2突變蛋白轉基因小鼠（24.5個月）經歷時間短。這表明在HBV慢性感染中2種突變蛋白的共同表達可能會增強致癌性[33]。

5小結與展望

慢性HBV感染是導致HCC發生風險增大的主要因素。HBV基因4個部分重疊開放閱讀框內的多種HBV基因突變與HCC的發生密切相關，可作為預測HCC發生的生物學指標。HBV基因突變可通過多種機制促進HCC發生，包括突變蛋白、細胞周期、細胞凋亡等相關蛋白結合，促進細胞的增殖，導致染色體不穩定，突變蛋白分泌障礙，可造成內質網應激引起細胞內活性氧族增加，突變基因易于整合到宿主染色體造成后者不穩定，突變蛋白降低了病毒抗原表達或抗原表位親和力，進而促使感染細胞逃逸免疫監視等。要完全闡明HBV基因突變在HCC發生發展中的作用，還須進行臨床前瞻性的大樣本隊列研究，在細胞和動物模型上進行更深入的功能學實驗。

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（2015-08-21收稿 2015-09-10修回）

（責任編委 張玲霞 本文編輯 陳玉琪）

Research progress of the relationship between HBV mutations and occurrence of hepatocellular carcinoma

NIAN Xue-yuan,XU Zhi-hui,LIU Yan,XU Dong-ping*
Research Center for Clinical Medicine,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China

HBV infection is the main etiologic factor for occurrence of hepatocellular carcinoma(HCC),accounting for more than 50％of the cases.Therefore,prevention and treatment of HBV infection has become a hot issue in the world.The HBV mutations, which include point mutation,deletion,insertion and truncation in 4 open reading frames(S,C,P,and X)are suggested to be associated with HCC pathogenesis.Some mutations related with aggravation of hepatitis B may serve as a biomarker to predict HCC occurrence. Some mutant HBV antigens may directly or indirectly regulate cell cycle,apoptosis,and other related proteins,which promote cell proliferation and chromosome instability and therefore increase the risk of HCC occurrence.

hepatitis B virus;carcinoma,hepatocellular;mutation

R373.21；R735.7

A

1007-8134(2015)05-0000-00

國家自然科學基金（81373136、81271847）

100039北京，解放軍第三〇二醫院臨床研究管理中心（粘學淵、許智慧、劉妍、徐東平）

徐東平，E-mail:xudongping302@sina.com

*Corresponding author,E-mail:xudongping302@sina.com