慢病毒介導(dǎo)uPA-siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞增殖

史晨輝，王維山，李長(zhǎng)俊，張振東，郭風(fēng)勁，陳安民*

(1.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 附屬同濟(jì)醫(yī)院 骨科, 湖北 武漢 430030； 2.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 骨科， 新疆 石河子 832000)

研究論文

慢病毒介導(dǎo)uPA-siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞增殖

史晨輝1,2，王維山1,2，李長(zhǎng)俊2，張振東2，郭風(fēng)勁1，陳安民1*

(1.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 附屬同濟(jì)醫(yī)院 骨科, 湖北 武漢 430030； 2.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 骨科， 新疆 石河子 832000)

目的構(gòu)建篩選出靶向特異uPA-siRNA慢病毒表達(dá)載體，感染軟骨細(xì)胞后觀察其對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及代謝的影響。方法根據(jù)siRNA原理設(shè)計(jì)、構(gòu)建4對(duì)靶向兔uPA siRNA序列(P1、P2、P3和P4)，用RT-PCR篩選出高效靶向的P2序列。各序列經(jīng)慢病毒包裝后，通過(guò)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入兔軟骨細(xì)胞后，用RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)uPA-siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)uPA mRNA和蛋白表達(dá)水平的抑制效果，用CCK-8法檢測(cè)uPA-siRNA對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果成功構(gòu)建4對(duì)uPA-siRNA序列并篩選出用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的高效靶向P2序列，各序列經(jīng)慢病毒載體包裝并成功轉(zhuǎn)染到原代軟骨細(xì)胞中，在感染復(fù)數(shù)(MOI)為100時(shí)感染率達(dá)到85%以上。P1、P2、P3和P4均可抑制軟骨細(xì)胞中uPA基因及蛋白的表達(dá)，但P2沉默效果最好，基因抑制率達(dá)到70%，感染后軟骨細(xì)胞的增殖受到促進(jìn)。結(jié)論成功構(gòu)建高效靶向uPA-siRNA慢病毒載體，證實(shí)其可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞并高效抑制uPA基因表達(dá)并促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。

siRNA；RNA干擾； 慢病毒載體；軟骨細(xì)胞；增殖

尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, uPA)是絲氨酸蛋白水解酶家族的主要成員，其與uPA受體(urokinase-type plasminogen activator receptors，uPAR)形成復(fù)合物作用于生理、病理?xiàng)l件下的細(xì)胞遷移、組織修復(fù)、介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的水解、裂解膠原蛋白酶、激活其他蛋白水解酶以及直接降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜等過(guò)程，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和滑膜炎性反應(yīng)等密切相關(guān)[1-3]。……