出血性腦卒中患者急性期外周血內皮祖細胞數量變化的初步研究

宋黃成 張 松 朱為民 虞 聰 俞俊杰 劉一坤 袁斌斌

1）江蘇海門市人民醫院神經外科 海門 226100 2）復旦大學附屬華山醫院神經外科 上海 200040

腦卒中（Stroke）具有高發病率、高致殘率和高致死率，是當前嚴重威脅人類健康的三大主要疾病之一。隨著當今社會的老齡化，腦卒中發病率還在不斷增高。腦卒中高居西方發達國家人口死亡原因第3位，也是導致殘疾的首要原因。在我國，腦卒中是目前發病率、致死率、致殘率占首位的疾病。全球每年有554萬人死于腦卒中［1］。我國每年有近150萬人死于腦卒中，并新增200萬患有殘疾的幸存者。隨著我國人口老齡化的加速，我國腦卒中的發病率正以每年近9%的速度上升，腦卒中已成為威脅老年人健康的主要疾病之一。腦卒中包括缺血性和出血性卒中兩種。腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是常見的腦血管類疾病，屬于腦卒中的一種，占卒中發病率的15%。因發病原因不同分為兩類，第一類是高血壓性腦出血，由于高血壓導致動脈粥樣硬化及淀粉樣病變從而引起腦出血，這是腦出血中的主要類型；第二類是由于動靜脈畸形（AVM）、動脈瘤（aneurysm）及其他凝血功能紊亂造成的腦出血。高血壓腦出血常發生于大腦半球深部的基底節區域，主要出血部位在腦內毛細血管級別的小血管中，如大腦中動脈的二級分支豆紋動脈、基底動脈的腦橋支等。出血型腦卒中相對于缺血型腦卒中具有更高的病死率和致殘率，我國每年130萬～150萬人發病，病死率為40%～60%，存活者遺留嚴重殘疾的約占40%。

Asahara等［2］于1997年首次從外周血單核細胞中提取出具有干細胞的增殖能力的CD34（＋）的細胞亞群，同時發現其可以分化為成熟內皮細胞并命名為內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）。越來越多的研究發現，EPC在特定細胞因子（VEGF、GM－CSF、SDF－1、IL－6、EPO、Statins等）的趨化作用下迅速集中于血管損傷或內膜缺損部位，維持內皮細胞的完整性并參與血管的修復和再生。大量的動物和臨床試驗已證實增加外周血中功能性EPC的含量或動員內源性的EPC均可保護機體血管內皮系統的穩態，防止內皮損傷所造成的病變進一步加重［3－5］。目前外周血中內皮祖細胞可作為評估患者內皮損傷程度和血管修復能力的重要指標。有實驗研究指出，在大鼠腦出血后，血管新生的相關因子的表達量會上調。研究發現，在腦出血后檢測到VEGF、Flt－1和Flk－1等血管新生的相關因子表達量上調［6］，認為腦出血可引起血管新生。而內皮祖細胞作為新生血管內皮細胞的前體細胞，必然參與血管新生和血管修復的過程。至今國內關于出血性腦卒中患者外周血中急性期內皮祖細胞數量變化的研究少有報道，本文將通過初步檢測3例急性腦出血的患者第1～10天外周血中內皮祖細胞的數量變化和部分功能研究，探討出血性腦卒中患者急性期外周血中內皮祖細胞與患者預后的關系。

1 材料和方法

1.1研究對象急性腦出血患者3例（具體資料見表1），來源于本院2013－01—02住院患者，其中左側基底節區腦出血2例，出血量分別為50mL和90mL（破入腦室），右側基底節區腦出血1例，出血量為20mL。如圖1所示。

1.2儀器FACSCalibur流式細胞儀，美國BD公司產品，用CELLQuest軟件（BD公司）獲取和分析實驗數據。SF 23000血球計數儀，日本東亞公司產品。

1.3試劑CD34－PE單抗，同型對照IgGa2PE、KDR－APC均由德國美天旎公司提供，紅細胞裂解液由美國BD公司提供，EGM－2細胞培養液由美國LONZA公司提供，人纖維連接蛋白由Sigma公司提供，Dil標記的乙酰化低密度由Molecular Probes公司提供，FITC標記的Ⅰ型荊豆凝集由Sigma－Aldrich公司提供，DAPI由 Molecular Probes公司提供，6孔細胞培養板由美國Corning公司提供，PBS由美國Gibco公司提供。

圖1 3例高血壓腦出血患者急診入院頭顱CT顯示出血情況 a為60歲左側基底節區腦出血的患者，出血量約50mL，b為約50歲左側基底節區腦出血的患者，出血量約20mL，c為約80歲左側基底節區腦出血的患者，出血量約為90mL，且破入腦室

表1 3例病人的資料

2 方法

2.1標本處理采集EDTA.K2抗凝的靜脈血1～2mL，加入1X紅細胞裂解液10mL，混勻，室溫孵育15min，1 000 rpm離心5min。棄上清，混勻，加入3～5mL PBS，1 000 rpm離心5min×2次。棄上清，加入80μL PBS重懸后加入10μL CD34－PE和10μL KDR－APC抗體并置于4℃暗室孵育30min后，1 500rpm離心5min。棄上清，加入500μL PBS重懸后，1 500rpm離心5min×2次。棄上清，加入400 μL PBS重懸后至流式管中上機檢測。對照管中作類似處理。

2.2儀器設置和數據分析用FACSComp調整FSC、SSC、FL2和FL3電壓。用CELL Quest軟件獲取100000個細胞進行分析。以對數FSC作為X軸，對數SSC作為Y軸，選取有核細胞圈門P2。以對數 KDR－APC作為 X軸，對數SSC作為Y軸，Format P3到本窗中，選取KDR陽性細胞圈門P3。另開一個窗，以對數CD34－PE作為X軸，對數SSC作為Y軸，Format P3到本窗中。以對照管調整mark的位置。在同等的實驗條件下，用以分析測定管（見圖2）。P4框內即為循環內皮祖細胞群值。

2.3統計學處理采用SPSS統計軟件分析，計數資料用（s）表示，2組間均數比較采用ANOVA檢驗。

圖2 流式細胞術檢測循環內皮祖細胞圖（P4框內為循環內皮祖細胞群）

3 結果

3.1 3例腦出血患者第1～第10天外周血中內皮祖細胞的測定結果（見圖3）。從圖3a我們看出，50歲和60歲患者在出血的超急性期外周血中EPC含量很高，幾乎為急性期的最高峰，然后隨時間延長其含量逐漸降低，第4天幾乎達到最低值，術后第7天和第5天再次升高。而80歲患者在急性期第2天外周血中EPC達到最高峰，然后隨時間逐漸下降，第6天再次達到高峰。而圖3b通過統計分析可以得出，腦出血患者在超急性期EPC被大量動員，達到最高峰，然后隨時間延長其含量逐漸降低，第4天降到最低值，第7天再次達到一個新的峰值。

圖3 圖a示分別測定3例腦出血患者第1～第7及第10天外周血中內皮祖細胞的變化情況，b示3例患者第1～第7及第10天外周血中內皮祖細胞的整體變化趨勢

3.2 50歲患者外周血中超急性期內皮祖細胞的培養和鑒定在第2例患者入院當天通過流式檢測該病人外周血中EPC含量很高，遂在病人知情同意下通過靜脈抽取肝素抗凝的外周血20mL，用PBS等倍稀釋后加入淋巴細胞分離液，通過密度梯度離心的方法提取單核細胞（如圖4）。然后將細胞按照密度為1×106個／L接種在加有EGM－2完全培養液的預涂纖連蛋白的6孔培養板中，置37°C、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。3d后換液，將未貼壁細胞棄之。此后每隔3d更換培養液。每天拍照觀察細胞生長情況和形態變化（如圖5）。并對細胞行內皮細胞內吞功能測定（Dil－ac－LDL與FITC－UEA－1）和流式鑒定［CD31（＋）KDR（＋）］。見圖6。

圖4 密度梯度離心法提取外周血MNC 下面箭頭所指為外周血加入淋巴細胞分離液離心后看到的明顯的白沫層，即單核細胞層

4 討論

內皮祖細胞于1997年被Asahara等［2］學者在外周血中首次發現，該細胞在各種趨化因子的誘導下能夠從骨髓中動員，遷移并聚集到血管損傷部位，替換受損的內皮細胞并分化成成熟的內皮細胞從而保持內膜完整，維持血管內皮系統的穩態，并可作為評價血管內皮功能的一個有效標志物［7－8］。目前尚無關于內皮祖細胞表面抗原特異性鑒定的統一標準，但普遍認為CD34（＋）KDR（＋）細胞為外周血中循環內皮祖細胞，因此本文也將二者雙陽性的細胞定義為PBEPC（如圖2）。

高血壓腦出血，因腦血管破裂引起腦血流循環障礙和腦組織功能或結構的損害，又稱為出血性腦卒中。組織病理證實高血壓患者血管病理變化主要為細動脈的硬化。因此在腦血管破裂前，患者必定存在血管內皮細胞的損傷。而內皮祖細胞目前可作為一個良好評估血管內皮功能的maker，同時其數量和功能可作為血管修復能力的一個有效指標。我們通過檢測3例高血壓腦出血患者連續7d和第10d外周血中內皮祖細胞的變化，觀察3例高血壓腦出血病人在出血急性期骨髓中的EPC被大量動員，并隨時間推移EPC被消耗，而出血后第7天EPC再次在外周血中達到高峰。因此我們的假設是在高血壓腦出血的急性期，由于損傷血管釋放IL－6、TNF－α等趨化因子，骨髓池中的EPC被募集到血管損傷部位，從而參與血管的修復。而無論是開顱血腫清除術抑或是保守治療，隨著血腫的減少或吸收和血腫周圍水腫的逐漸減輕，破裂血管周圍腦組織的功能恢復乃至神經再生非常依賴新生的血管。血管新生的一種是從已有的血管上長出芽孢從而形成新的毛細血管［9］。而內皮祖細胞作為血管內皮細胞的前體細胞也必然參與血管新生的過程。故出血后第7天再次達到高峰。同時發現EPC的動員與年齡有一定的相關性，年齡越大，動員能力越差。圖3a顯示80歲患者在超急性期外周血EPC未達到最高峰，相反在出血后第1天達到峰值，而且急性期總體動員能力遠不如50歲和60歲患者。說明EPC的動員能力可能隨年齡增長減弱。通過前文論述推測，在同齡同部位同出血量情況下，排除影響EPC的諸多因素外，EPC的動員和患者的預后存在一定的相關性。另外，我們通過培養某一超急性期外周血EPC含量最高患者的單核細胞，發現該患者在接種時即有很多小錘狀的細胞，而培養1周左右該細胞便大量增殖并形成類似晚期EPC的旋渦狀，而進一步的培養并未形成晚期EPC。我們猜想：該患者被大量動員到外周血的EPC，也許較正常人存在功能上的某些缺陷，從而無法形成典型的鋪路石樣晚期EPC。由于無法培養出晚期EPC，我們無法與正常人進行克隆增殖能力、成管能力、遷移能力的比較，從而無法準確進行細胞功能的鑒定。但該患者從一定意義上說明了高血壓腦出血患者外周血中EPC存在功能缺陷。另外，通過對3例患者急性期每天CCS評分發現，外周血中EPC含量高的患者恢復相對較快。如前文所述，腦出血本身可引起血管新生，毫無疑問，EPC參與血管新生，且含量越高，越能促進和加快血管新生，從而改善卒中區腦組織血供，改善患者預后。EPC變化可能與腦卒中的預后有密切關系，有望作為出血性腦卒中預后觀察的指標。

查閱國內文獻，多數研究集中于出血性腦卒中患者急性期內皮祖細胞（EPC）數量的變化與卒中危險因素或炎癥因子方面［10－12］，目前尚無文獻報道腦卒中患者急性期外周血內皮祖細胞的動員情況和細胞功能變化。我們初步探討了3例高血壓腦出血患者急性期外周血中EPC的變化，雖然在一定層面上說明了EPC的動員情況和部分功能變化，但由于樣本量太小，無確切的統計學意義。因此，今后大樣本的出血性腦卒中患者急性期外周血內皮祖細胞的數量和功能變化有待進一步研究。

圖5 在低細胞密度、低血清環境下分離和純化的患者外周血單個核細胞（PBMMNs），于含有VEGF、FGF、IGF－1、EGF等生長因子的環境中成功培養出內皮祖細胞（PBEPCs）。a為剛接種的細胞，箭頭所示為如同錘狀的不規則細胞，可能為動員到外周血中的EPC；c為接種1周后細胞形成漩渦狀，如同晚期EPC形態，d為20倍鏡看到的典型的早期EPC形態，紡錘狀不規則形態；e為接種近2周后細胞的狀態，形成具有克隆能力的“集落”；g為接種近3周時細胞的狀態，未看到典型的鵝卵石或鋪路石樣的晚期EPC。a，c，e，g分別為10倍鏡圖，標尺為200μm；b，d，f，h為20倍鏡圖，標尺為100μm

圖6 a：人外周血內皮祖細胞免疫熒光鑒定 Dil－ac－LDL與 FITC－UEA－1熒光雙染（c）（DiI－acLDL為紅色，FITC－UEA－1為綠色，Dapi為藍色；b：EPC流式鑒定結果：CD31 99.6%（d），KDR 85.5%（e），CD31（＋）KDR（＋）90.7%（f）

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