雷帕霉素對體外培養瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響

[摘要]目的：雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）對體外培養瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用，深入探討其作用機制。方法：用雷帕霉素的不同藥物濃度干預體外培養瘢痕疙瘩成纖維細胞，CCK-8方法檢測對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響；免疫組化、RT-PCR和western blot檢測干預前后瘢痕疙瘩成纖維細胞中磷酸化的P70s6k、4E-BP1表達情況。結果：CCK-8檢測體外培養瘢痕疙瘩成纖維的吸光度，隨濃度和時間的增大而減小，各組之間差別具有統計學意義（P<0.05）；免疫組化（藥物濃度取10nmol/L），RT-PCR 和 western blot對不同藥物濃度（0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L）干預前后，基因表達和蛋白表達均下降，各組之間差別具有統計學意義（P<0.05）。結論：雷帕霉素對體外培養瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖有明顯的抑制作用，也抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞中磷酸化的P70s6k、4E-BP1表達。

[關鍵詞]雷帕霉素；瘢痕疙瘩；成纖維細胞；mTOR；P70s6k；4E-BP1

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）03-0207-06

雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）是一種新型的大環內酯類免疫抑制劑。Rapa的分子式為C51 H79NO13，分子量991ku，為白色固體結晶，熔點為183～185℃，親脂性，可溶解于甲醇、乙醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，極微溶于水，幾乎不溶于乙醚。起初被作為低毒性的抗真菌藥物，后來作為治療器官移植排斥反應試用，從目前動物實驗及臨床應用的效果看，Rapa是一種療效好、低毒、無腎毒性的新型免疫抑制劑[1]。近年來研究發現，Rapa對多種腫瘤有抑制作用，同時還具有神經保護和免疫調節等作用[2-4]。有研究報道，在體外培養瘢痕疙瘩的成纖維細胞中，抑制哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號途徑可以抑制成纖維細胞的生長，當病理性瘢痕成纖維細胞mTOR信號途徑受到抑制時，增殖細胞核抗原（PCNA）、cyclin D1、纖維粘連蛋白（fibronectin， FN）膠原纖維和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達都將下降[5]。因此，本研究擬通過Rapa干預成纖維細胞前后，同時觀察不同藥物濃度下P70s6k、4E-BP1的表達情況，進而進一步探討Rapa對瘢痕疙瘩的抑制作用及其形成機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1標本：5例瘢痕疙瘩標本分別來自于泉州市第一醫院和福建醫科大學附屬第二醫院整形美容科，術前經患者知情同意，術后病理證實為瘢痕疙瘩，并且患者術前無藥物及其他治療史，無患其他嚴重疾病。患者年齡9～28歲，瘢痕生長時間為6個月到2年。

1.1.2 主要試劑和儀器：雷帕霉素（分子式C51H79NO13，相對分子質量914.2，碧云天生物技術公司）；DMEM-F12培養基（GIBCO公司）；新生牛血清（PAA公司）；青鏈霉素原液（GIBCO公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）（碧云天公司）；P70s6k多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；4E-BP1單克隆抗體（Sigma 公司）；Beta-actin抗體（Santa Cruz公司）；Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）；引物合成（上海鼎安生物科技有限公司）；PCR基因擴增儀（ABI公司，9700）；全自動凝膠成相系統（Tocan公司）；RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒、UItraECL底物發光檢測試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）。

1.1.2 藥物配制：試驗時用DMEM-F12培養基稀釋為實驗濃度0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L。

1.2 方法

1.2.1細胞的體外培養：采取組織塊貼壁法進行成纖維細胞的培養。手術切下的瘢痕疙瘩小心去除表皮及皮下脂肪組織，剪成大小約 0.5～1mm3的小塊，加入少量小牛血清，接種于培養瓶中，在95%空氣， 5%CO2，37℃， 飽和濕度條件下培養24h，使組織塊牢固貼附于瓶壁，然后加入適量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM-F12培養液繼續培養，每周換液兩次，約3～4周，原代培養的細胞生長成單細胞層，幾乎覆蓋培養瓶進行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化至大部分細胞脫離培養瓶，以1：2的比例傳代培養，每隔2～3天用含20%小牛血清及雙抗的DMEM-F12培養液換液一次，待細胞鋪滿瓶底后傳代。實驗取3～6代成纖維細胞。

1.2.2細胞增殖抑制實驗：取對數生長期的細胞，調整細胞濃度為5×104/ml，取200μl接種于96孔培養板中。培養24h待細胞貼壁后，倒掉培養液，實驗組雷帕霉素的終濃度分別為0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L，每種濃度設5個平行孔，置95%空氣，5%CO2，37℃的培養箱內分別培養24h、48h和72h，測定前除對照組外，每種濃度每孔加CCK-8測定液20μl，放置細胞培養箱內約30min后，于酶標儀450nm處測定各孔吸光度A值。實驗重復3次，求平均值。設空白組作為測吸光度調零用。抑制率=1-實驗組A值/對照組A值。

1.2.3細胞爬片免疫組化檢測P70s6k、4E-BP1：取藥物濃度為10nmol/L進行定性檢測，實驗分組為：瘢痕疙瘩成纖維細胞非藥物干預組、瘢痕疙瘩成纖維細胞藥物干預組（濃度為10nmol/L）、正常皮膚成纖維細胞組，取對數生長期的細胞，調整細胞濃度為5×104/ml，取500μl接種于內含有蓋玻片的6孔培養板中的蓋玻片上，培養12h待細胞貼壁后，加入培養液繼續培養12h使細胞生長同步后，倒掉培養液。將細胞按分組情況分別置于不同的培養條件下，繼續培養48h后取出爬片，4%多聚甲醛4℃固定30min，PBS洗3min×3次，3%H2O2孵育15min，去除內源性過氧化物酶，PBS緩沖液3min×3次。P70s6k多克隆抗體稀釋為1：100；4E-BP1單克隆抗體稀釋為1：200的；后按試劑盒操作說明進行，最后并行蘇木素復染，同時以PBS代替一抗行陰性對照。結果采用生物醫學圖像分析系統（JD801）進行定量分析，檢測平均光密度（AOD）。

1.2.4 RT-PCR檢測P70s6k、4E-BP1基因的表達情況：Trizol一步法提取細胞總RNA，分別抽提正常皮膚成纖維細胞組、瘢痕疙瘩成纖維細胞非藥物干預組、瘢痕疙瘩成纖維細胞藥物干預組（0.1nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L），成纖維細胞的總RNA，調整RNA為1mg/L，以Beta-actin（β-actin）為內參對照，進行RT-PCR檢測。P70s6k引物序列為：上游引物5'GGGTGGAGGATG-CATGTAT3'，下游引物5'ACACAAACATAGATGAACCCAT3'，產物為452bp；4E-BP1引物序列為：上游引物5'CCTGATGGAGTGTGG GAACT3'，下游引物5'CGGAAGGAAGGGTTCGT3'；產物為463bp；內參Beta-actin（β-actin）引物序列為：上游引物5'CTGGGACGACATGGAGAAAA3'，下游引物5'AAGGA-AGGCTGGAAGAGTGC3'，產物為564bp。循環條件：預變性94℃ 5min，變性94℃ 30s，退火（P70s6k為59℃；4E-BP1為61℃）30s，延伸72℃ 1min，循環35次，終延伸72℃ 5min，4℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像分析系統觀察，拍照并進行分析，其代表數值為平均灰度值，代表相應基因的表達量，并除以β-actin的平均灰度值，所得數值作為各擴增產物的mRNA相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測P70s6k、4E-BP1蛋白的表達情況：將同步培養的正常皮膚成纖維細胞組、瘢痕疙瘩成纖維細胞非藥物干預組、瘢痕疙瘩成纖維細胞藥物干預組（0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L），干預48h后取出細胞，吸掉培養基，加入裂解液，在冰上裂解細胞提取總蛋白，進行蛋白定量；根據SDS-PAGE上樣量需要，調整蛋白濃度，100℃煮沸變性5min。根據目的蛋白的分子量，配制12%分離膠凝膠，濃縮膠濃度為5%。濃縮膠恒壓90V，約20min；分離膠恒壓150V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。半干轉膜，按照電流1.2mA/cm2膜面積，恒流轉膜；0.45μm孔徑PVDF膜，轉膜時間1.5h。轉膜后用麗春紅染色試劑對膜染色，觀察轉膜效果。室溫將膜浸沒在Western blot 封閉液Ⅱ中封閉30min，1：100的P70s6k多克隆抗體及1：200的4E-BP1單克隆抗體4℃孵育過夜，然后與1：2000的羊抗兔IgG（H+L）HRP二抗室溫孵育40min，與ECL反應曝光、顯影、定影，凝膠成像分析系統觀察，拍照并進行分析。以β-actin作為內參進行校正，分別計算出各組成纖維細胞中磷酸化的P70s6k和4E-BP1蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理：應用統計軟件SPSS11.5進行統計學分析，數據以x±s表示，采用單因素方差分析和成組t檢驗對結果進行統計學檢驗，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Rapa對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的抑制作用：以Rapa不同藥物濃度對瘢痕疙瘩成纖維細胞進行干預，檢測平均光密度（AOD）。實驗結果顯示不同藥物濃度對瘢痕疙瘩成纖維細胞均有抑制作用，并且呈現隨藥物濃度增大，抑制作用越強，隨作用時間越長，抑制作用越明顯的整體趨勢；表現出時間與濃度的依賴關系。

2.2 細胞爬片的免疫組化檢測細胞中P70s6k、4E-BP1蛋白表達情況：取藥物濃度為10 nmol/L進行定性檢測，實驗分組為：正常皮膚成纖維細胞組、瘢痕疙瘩成纖維細胞非藥物干預組、瘢痕疙瘩成纖維細胞藥物干預組。鏡下見P70s6k主要表達在胞質內，核內有少量表達，瘢痕疙瘩成纖維細胞非藥物干預組胞質染色為棕黃色（圖1），強陽性表達，較正常皮膚成纖維細胞組表達明顯增強；瘢痕疙瘩成纖維細胞藥物干預組胞質染色為淺黃色（圖2），表達較瘢痕疙瘩成纖維細胞非藥物干預組減弱；正常皮膚成纖維細胞組胞質染色為淺棕色（圖3），弱陽性表達。鏡下見4E-BP1主要表達在胞質內，核內也有少量表達，瘢痕疙瘩成纖維細胞非藥物干預組胞質染色為棕黃色（圖4），強陽性表達，較正常皮膚成纖維細胞組表達明顯增強；瘢痕疙瘩成纖維細胞藥物干預組胞質染色為淺黃色（圖5），表達較瘢痕疙瘩成纖維細胞非藥物干預組減弱；正常皮膚成纖維細胞組胞質染色為淺棕色（圖6），弱陽性表達。P70s6k藥物干預組陰性對照，胞質淡染（圖7），淺藍色；4E-BP1藥物干預組陰性對照，胞質淡染（圖8），淡藍色。通過對各組的AOD進行統計學分析，結果顯示P70s6k和4E-BP1蛋白在各組中表達有顯著性差異，P<0.01，具有統計學意義（表2）。

2.3 RT-PCR檢測Rapa對P70s6k、4E-BP1基因表達的影響：按實驗要求分別對各組細胞進行RNA的提取，并進行純度的鑒定，測得各樣品的OD260/OD280比值均在1.8～2.1之間，RNA樣品的純度較好。進行RT-PCR實驗，RT-PCR產物進行電泳跑膠，應用凝膠成像分析系統對各個組別電泳圖拍照（圖9、圖10）和檢測各樣本條帶的灰度值，并進行半定量的統計學分析。實驗結果顯示P70s6k和4E-BP1的mRNA在各組中表達有明顯差異，P<0.05，具有統計學意義（表3）。

2.4 Western Blot檢測Rapa對P70s6k、4E-BP1蛋白表達的影響：Western Blot印記法檢測P70s6k、4E-BP1蛋白表達水平，結果如圖（圖11，圖12），并用凝膠成像分析系統對膜上條帶進行拍照和檢測各樣本條帶的灰度值，進行半定量的統計學分析。結果顯示細胞中P70s6k和4E-BP1的蛋白在各組中表達具有明顯的差異，具有統計學意義P<0.05（表4）。

3 討論

本實驗應用不同濃度（0.1nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L）的Rapa處理體外培養的瘢痕疙瘩成纖維細胞我們發現，在同一時間內，瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制率隨藥物濃度的增大而增大，差異具有統計學意義（P<0.05），說明Rapa對瘢痕疙瘩成纖維細胞具有明顯的抑制其增殖和生長，誘導其凋亡的作用。大量的研究表明，mTOR信號途徑在多個腫瘤細胞的增殖[2-4]和多種膠原蛋白合成中發揮重要作用[6]，瘢痕疙瘩是創傷延遲愈合期間，由于過量結締組織的沉積形成的超出最初損傷范圍的增殖性瘢痕組織，目前雖然不能確定其確切的發病機制，也沒有普遍有效的治療藥物，但大量的研究證明，成纖維細胞是瘢痕疙瘩的效應細胞。近年來有研究報道，抑制mTOR信號途徑，可以抑制成纖維細胞的生長，膠原纖維合成下降[5]。

mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）特異性抑制劑Rapa能夠破壞mTOR及其聯結蛋白的相互作用，抑制mTOR活性，使由mTOR引起的下游P70s6k和4E-BP1磷酸化受阻，并且Rapa還能削弱mTOR和4E-BP1的相互作用[7-8]，通過抑制真核起始因子4E-結合蛋白-1（4E-BP1），阻止了真核起始因子eIF-4E的釋放和轉錄；通過抑制P70s6k的活化，阻遏核糖體蛋白S6的磷酸化，減少核糖體/轉錄蛋白的合成，抑制細胞生長增殖[9]。Rapa對瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖抑制作用明顯，且呈劑量-效應和時間-效應關系。本實驗也表明：Rapa對mTOR具有明顯的抑制作用，并隨藥物濃度增大抑制作用越強，瘢痕疙瘩加藥組較瘢痕疙瘩非加藥組中由mTOR激活磷酸化的P70s6k和4E-BP1表達下降。瘢痕疙瘩非加藥組和正常皮膚組在同一的培養條件、培養相同的時間下，瘢痕疙瘩非加藥組較正常皮膚組中磷酸化的P70s6k和4E-BP1明顯存在過表達，也驗證了mTOR信號途徑在瘢痕疙瘩形成中扮演著重要角色，磷酸化的P70s6k和4E-BP1的過表達可能是成纖維細胞持續增殖形成瘢痕疙瘩的機制之一。

阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡是一些化療藥物作用腫瘤的重要機制，正常細胞和腫瘤細胞的都有賴于細胞周期的運行，腫瘤治療的中心環節就是干擾腫瘤細胞的細胞周期，從而使腫瘤細胞增殖速率減慢或誘導細胞走向凋亡。瘢痕疙瘩的產生是多種因素參與的成纖維細胞的過度增殖造成的，臨床上認為瘢痕疙瘩是高分化腫瘤。Rapa可通過阻斷腫瘤細胞中關鍵mRNA的翻譯，破壞細胞周期蛋白、CDK抑制劑在細胞周期的平衡，導致細胞周期停滯和細胞凋亡[10]。近年有研究報道，Rapa通過抑制P27介導的cdk-2細胞周期素的激活和DNA的合成，顯著降低S期激酶相關蛋白2 （Skp2） mRNA和蛋白質的水平，使細胞生長停滯于G1期[11-12]。因此筆者認為，Rapa對瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用，也是通過阻滯瘢痕疙瘩成纖維細胞G1期向S期的進程，造成G1期細胞堆積阻滯，調控蛋白質翻譯而控制細胞周期相關的周期蛋白的產生和調節真核起始因子eIF-4E的釋放和轉錄及核糖體/轉錄蛋白的合成水平，使瘢痕疙瘩成纖維細胞停滯在G1期，進而誘導凋亡。

Rapa是鏈霉菌屬絲狀菌發酵產生的一種具有抗真菌作用的大環內酯類抗生素，起初被用為低毒性的抗真菌藥物，1977年發現Rapa具有免疫抑制作用，1989年開始把Rapa作為治療器官移植排斥反應的新藥進行試用，1999年美國AHP公司把它成功開發為比環孢素活性強100倍、腎毒性最低、唯一不誘發腫瘤發生，用于器官移植抗排斥強效免疫抑制劑新藥投放市場。最近研究發現Rapa不僅是新型免疫抑制劑，而且有廣泛的抗腫瘤作用[2]。美國國立癌癥研究所等機構研究發現，Rapa對眾多腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、白血病、肺癌、腎癌等，均有明顯抑制作用。瘢痕疙瘩是一種體表的增生性疾病，目前仍沒有切實有效的藥物，Rapa以其經濟、方便、副作用少等優點，極其可能成為新的、經濟有效的抗瘢痕疙瘩藥品。

Rapa對瘢痕疙瘩成纖維細胞抑制作用的研究，為瘢痕疙瘩的臨床藥物治療提供一個新的思路；對P70s6k和4E-BP1的抑制作用及其對下游效應因子影響的分子機制，需要進一步探討，有利于揭示瘢痕疙瘩形成的確切機制。

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[收稿日期]2011-04-13 [修回日期]2014-01-22

編輯/張惠娟