兔骨髓間充質干細胞在HA/CS支架中的增殖活性

[摘要]目的：研究骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在羥基磷灰石（HA）/殼聚糖（CS）復合支架材料中的生長和增殖情況，探討復合材料與細胞的相容性。方法：穿刺法抽取新西蘭大耳白兔骨髓3ml，通過密度梯度離心法獲取MSCs，體外貼壁培養，倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細胞形態、數量生長情況，描繪生長曲線。將第2代細胞以高密度接種到支架材料中體外三維培養，觀察其細胞相容性。結果：經密度梯度離心結合貼壁篩選得到純化的間充質干細胞， 細胞能夠連續傳至9代以上，第2、5代細胞增殖能力最強。細胞進行體外三維培養時，可在HA/CS復合支架材料上良好的附著、生長和增殖。結論：兔骨髓間充質干細胞能在體外成功培養， HA/CS復合支架與MSCs具有良好的細胞相容性。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；體外培養；HA/CS支架

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）03-0213-04

骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的干細胞，其在特定條件下可向成骨細胞、成軟骨細胞、肌鍵細胞等多種細胞分化，是一種重要的組織工程種子細胞[1]。但骨髓中MSC的含量極低，僅占單個核細胞的0.001%～0.01%[2]。在體外培養條件下對其進行分離、純化和擴增是MSCs研究和應用的前提條件。本實驗采用貼壁篩選的方法從骨髓中分離MSCs并對其純化，對其在整個生命周期的形態、傳代、增殖狀態進行研究，探討體外分離培養MSCs的生長規律，為大規模地獲得生物學性狀良好的骨髓MSC應用于骨和軟骨損傷的臨床應用奠定基礎。同時研究三維培養條件下，羥基磷灰石（HA）/殼聚糖（CS）復合支架材料對骨髓間充質細胞粘附、生長、增殖等功能的影響，尋找適宜的干細胞載體，作為移植修復組織缺損的供體材料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料：新西蘭純種大耳白兔一只，2月齡，體重2.0～2.5kg， HA支架從四川大學生物材料中心購買，CS粉由上海其勝生物公司購買， 人淋巴細胞分離液，PBS（中山金橋公司），肝素，DMEM低糖培養液（Gibco），小牛血清（中國軍事科學院），胰蛋白酶（Sigma）， EDTA（Sigma）， 超凈工作臺（蘇州凈化儀器公司），CO2孵育箱（美國NAPCO），倒置顯微鏡（尼康）。

1.2 MSC的取材、培養

1.2.1 取材：用麻醉劑速眠新注射液肌肉注射動物（0.3ml/kg），將兔麻醉后，側臥手術臺上，于后股骨下段處剪毛備皮，體積分數0.01活力碘消毒，鋪無菌洞巾， 12號骨髓穿刺針接10ml注射器，穿刺進入骨髓腔，含稀釋（500U/L）的肝素鈉濕潤針管后，抽取骨髓液約2～4.0ml，注入無菌離心管中。

1.2.2 將抽取的骨髓等體積加入人淋巴細胞分離液離心10min，分3層，去掉上清，再次PBS漂洗混勻離心，去掉上清除去脂肪等，取中間灰白色絮狀層 （此層為所要的細胞層）。按5×l05cells/ml的密度接種接于25cm2培養瓶中。培養液為含10%胎牛血清（FBS）、L-DMEN培養基。在5%CO2、37℃飽和濕度的培養箱中進行培養。第2天換半液，第4、7天換全液，換液時將原來的培養液直接吸出，用培養液洗滌2次以去除懸浮細胞，加入新的培養體系繼續培養。每3～4天換液一次并觀察其生長狀態。待貼壁細胞的密度達到80%～90%時，進行傳代培養。

1.2.3 傳代：細胞生長達到近融合狀態后，吸除培養液，少量PBS洗滌一次，加入1ml的消化液（含0.02% EDTA及0.25%胰蛋白酶），放入細胞培養箱內5min后，低倍鏡下見大部分細胞胞質回縮、形態變圓后，加入適量的含血清的DMEM培養液中止消化，收集細胞懸液、計數，以5×103/cm2細胞密度接種于新的培養瓶內，繼續在相同的條件下培養。隔日更換三分之二量的培養液，一般4～5天后又可達到近融合狀態。

1.2.4 生長曲線：分別取第2、5、8代的MSC，用胰蛋白酶消化后加入L-DMEM 完全培養液，調整細胞密度至2.0×104/L，接種于3個24孔培養板中，培養板上作相應標記，每孔細胞懸液1.0ml 。每天每板取3孔消化，形成細胞懸液，混勻，對細胞計數并計算均值，連續9天。然后以時間為橫坐標，細胞數為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3 MSCs一生物材料復合物的形成與體外培養

1.3.1 支架材料的準備：采用凍干法制備雙層HA/CS復合支架，稱取CS 0.3g溶于0.2mol/L的醋酸10ml配成濃度為3%（w/v） 殼聚糖溶液，同是加入分子量1000聚乙二醇1g，放入溫水中以溶解臘狀聚乙二醇，離心去除氣泡。將4×1mm HA放入4×4mm的模具中，取配好的殼聚糖溶液，倒入模具中，注意讓殼聚糖溶液停留在HA支架上1min，放入冰箱-20℃冷凍10h，在冷凍抽干機中凍干24h，制成羥基磷灰石（HA）/殼聚糖（CS）支架，將凍干的羥基磷灰石（HA）/殼聚糖（CS）支架放入0.1mol/LNaOH中，中和支架內的醋酸溶液，反復PBS液沖洗，至PH值中性。

將HA/CS復合生物材料置75%酒精浸泡2h后，紫外線消毒1/2h，PBS緩沖液沖洗數次，無血清的DMEM培養液浸泡24h過夜，吸干培養液，準備接種。

1.3.2 細胞懸液的準備：選擇一瓶第2代近融合的細胞，消化后，收集細胞懸液，離心，計數，一般回植的細胞濃度要求達到1.0×106個/ml。

1.3.3 接種：將支架材料中的培養液完全吸干，支架材料回縮，取離心后的細胞懸液0.5m1，用微量加樣器或滴管將其加到支架材料上，使細胞懸液均勻地浸于生物支架材料上，移至6孔板中，細胞一材料復合物于37℃，5%CO2，100%飽和濕度的條件下培養4～5h后加入相應的培養液繼續培養。（高濃度懸液，4～6h后開始貼壁，加培養液防止細胞營養不夠而死亡）。

1.3.4 體外觀察與培養：培養物隔日換液，以倒置顯微鏡觀察MSCs的基質分泌及其與HA/CS的粘附情況。

2 結果

2.1 原代細胞培養：原代細胞多呈圓形或橢圓形，第1次換液后可見大部分呈梭性的貼壁細胞，細胞形態變長；以后拉長的細胞增多，逐漸以梭形細胞為主，部分呈三角形；第 7天時可觀察到數十個細胞聚集生長組成的集落（見圖1）；集落逐漸增多，集落中細胞數量亦增多，細胞為成纖維樣細胞；10～12天后集落相互融合，形成致密貼壁層，細胞呈草束狀排列（見圖2）。

2.2傳代細胞：隨傳代次數增加，MSC的增殖能力開始減弱，細胞向多角形發展，生長速度降低；8代以后細胞胞體增大，生長速度明顯減慢，細胞形態變為扁平，呈現老化現象（見圖3）。其中第2、5代細胞增殖能力最強，第8代細胞與第2、5代細胞比較增殖能力明顯減弱。

2.3 生長曲線：3代細胞生長曲線都呈S形，傳代后的1～2天細胞進入生長滯緩期，細胞增殖數量不多，主要為MSCs的貼壁生長階段，培養細胞的有絲分裂活動不太活躍；從第3日開始細胞增殖加速，相差顯微鏡下可以觀察到貼壁細胞已形成大小不一的多個細胞克隆，第3～7日這些細胞克隆進一步擴大，許多細胞克隆彼此相連，細胞顯示呈對數增長，為對數增長期；7～8天后增殖速度逐漸減慢進入平臺期，細胞數目基本不再增多（見圖4）。

2.4 高密度細胞懸液剛注入HA/CS復合支架材料時，在其邊緣僅能看到少量圓形未貼壁的懸浮細胞，5天后可見其邊緣細胞數量增多，且部分細胞形態變為梭形，小部分細胞仍呈圓形；隨著培養時間的延長，支架上的細胞數量逐漸增加，但明顯慢于二維培養的細胞增殖速度，增殖細胞聚集呈簇狀。14天后觀察可見大量細胞從支架材料中爬行出來，呈網狀排列，在支架材料的周圍可見大量梭形細胞生長狀態良好（見圖5、6），表明間充質干細胞能在支架材料上良好地附著、生長和增殖。

3 討論

骨髓間充質干細胞是骨髓中一些未充分分化的類中胚層細胞，與骨、軟骨、脂肪等組織具有起源上的相關性，在一定條件下，有很強向這些組織分化的潛能[3]，因此間充質干細胞在組織工程、細胞治療和基因治療中具有廣闊的應用前景。間充質干細胞可來源于骨髓、脂肪、肌肉和滑膜等組織，其中，骨髓間充質干細胞可從骨髓穿刺獲取，操作容易，損傷少，是目前研究得最多，也是最有可能應用于臨床的間充質干細胞。骨髓間充質干細胞能在多種三維支架上粘附、生長、增殖和分化，并復合三維支架材料移植修復組織缺損[4-5]。

可生物降解和組織相容性的三維支架材料是組織工程學研究的重要內容之一。人工合成支架（如PLA、PGA），盡管被證明支持細胞粘附、增殖、分化等優點，但也存在缺乏識別信號，親水性性差，對細胞吸附能力弱，生物降解慢，引起纖維變性和免疫反應。天然材料最突出優點是無抗原性，生物相容性好，具有細胞識別信號，有利于細胞粘附、增殖和分化，與細胞外基質結構相似，但也存在許多缺點，如機械強度不足、降解速度快以及大規模生產的限制等。

目前，國外和國內軟骨組織工程支架的研究趨向于多種材料復合支架。通過調整支架材料的比例，使得復合支架更適于軟骨細胞的粘附、增殖、分化和維持表型。本研究中應用的殼聚糖具有良好的生物降解性和生物相容性，是海洋無脊椎動物外殼上的甲殼素脫乙酞基后的產物，來源廣泛，取材料方便，其化學結構為（1，4）-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，其降解產物在體內不積聚，無毒，無刺激，無免疫原性，無熱原性、無致畸和致突變效應[6]，廣泛用于生物醫用領域。而羥基磷灰石則可提高支架的力學強度，從而克服天然支架材料普遍存在力學強度不夠的問題。實驗中讓殼聚糖溶液停留在HA支架上1min，放入冰箱-20℃冷凍10h，在冷凍抽干機中凍干24h，制成羥基磷灰石（HA）/殼聚糖（CS）支架，將凍干的羥基磷灰石（HA）/殼聚糖（CS）支架放入0.1mol/LNaOH中，中和支架內的醋酸溶液，反復PBS液沖洗，至PH值中性，可制成適宜于細胞載體的復合材料支架。再將細胞置于復合支架內三維培養14天，結果發現，細胞能在支架材料上良好的附著、生長和增殖。這表明骨髓間充質干細胞與HA/CS復合支架有良好的細胞相容性，可作為骨髓間充質干細胞的良好載體。

[參考文獻]

[1]Knippevberg M，Helder MN，Doui_Abi BZ，et al.Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells acquire bonecell-like responsiveness to fluid shear stress on osteogenic stimulation[J].Tissue Engin，2005，11（11-12）：1780-1788.

[2]Lin HT，Tarng YW，Chev YC，et al.Using human plasma supplemented medium to cultivate human bone marrow-derived mesenchymal stem cell and evaluation of its multiple-lineage potential [J].Transplant Proc，2005，37（l0）：4504-4505.

[3]Caplan AI.Mesenchymal stem cells [J].J Orthop Res，1991，9（5）：641-650.

[4]Guo X，Wang C，Zhang Y，et al.Repair of large articular cartilage defectswith implants of autologous mesenchymal stem cello seeded into beta-trical-cium phosphate in a sheep model [J]. Tissue Eng， 2004， 10（11-12）：1819-1829.

[5]BosnakovskiD，Mizunl M，Kim G，et al.Chondrogenic dedifferentiation ofbovino bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs）in different hydrogels：influence of collagen typeII extracellular matrix on MSC chondmgenesis[J].Biotechnol Bioeng，2006，93（6）：1152-1163.

[6]Lee YM，Perk YJ，Lee SJ，et a1.Tissue engineered bone formatiqn using chitosanitricalcium phosphate sponges [J].Periodontol，2000，71（3）：410-117.

[收稿日期]2011-02-23 [修回日期]2014-01-10

編輯/張惠娟