低毒高效的植物石蠟切片方法

李鳳英　馬姜明　梁士楚　唐紹清　薛躍規

摘要：以喬木、灌木和藤本等不同類型植物葉及部分根莖為試驗材料，對石蠟切片的主要技術環節進行了探究和改進。用天然有機溶劑松節油（oil ofturpentine）代替二甲苯（xylene）為透明與脫蠟劑，以阿拉伯樹膠（gum acacia powder）為貼片劑，采用番紅整體染色與固綠分片染色相結合進行雙重染色。試驗結果表明，該方法可避免二甲苯的毒性危害，減少環境污染，縮短試驗所需的時間，提高勞動效率和制片質量。

關鍵詞：石蠟切片；植物；低毒高效；方法

中圖分類號：Q94-336

文獻標志碼：A

論文編號：2013-0773

0 引言

石蠟切片是植物顯微技術上最重要最常用的一種方法，在植物解剖學及其相關領域的生產和科研中有著廣泛應用。尤其是近年來，隨著科學技術的發展與植物生態解剖學的興起，石蠟切片技術重新活躍于植物科學研究領域，并成為了不同生境植物或演替系列優勢種生態適應性研究的重要手段。但是，傳統的石蠟切片方法不僅耗時長，而其常用的透明劑——二甲苯，氣味奇臭難聞，是有機合成易揮發的可疑致癌物，毒性較大。二甲苯能夠通過呼吸道和皮膚粘膜進入人體，損害神經和血液系統，對制片工作和人體健康構成了潛在的危險。加上石蠟切片程序復雜、步驟煩瑣，不易切出滿意的切片。因而石蠟切片技術的改進一直是學者關注和研究的重要問題之一。自20世紀50年代末以來，李正理教授曾多次修訂出版了《植物制片學》、《植物制片技術》和《植物組織制片學》，為植物石蠟切片等奠定了技術基礎。近年來，不少學者對植物石蠟切片技術進行了一些有益的探索和改進，如植物制片多重整體染色技術的研究、透明和脫蠟技術的改良、包埋和修蠟過程的改進，常規植物石蠟制片技術的改進，以及蕨類植物石蠟切片制作技術探討等。但在低毒、快速的關鍵性技術問題上尚未見有大的突破或全面系統的報道，關于選用天然低毒有機溶劑為透明劑的研究鮮見報道。自2005年以來，結合科研工作和實踐教學，以植物的根、莖、葉為主要試驗材料，對傳統植物石蠟切片的主要技術環節進行了探究和改進。優選無毒透明脫蠟劑、高效貼片劑，優化番紅與固綠的對染方法，精簡脫水、透明和浸蠟等試驗操作流程。2012年在學校實驗室項目的資助下，利用改進的石蠟切片技術對100余份包括喬木、灌木和藤本不同類型植物的葉組織材料進行了解剖觀察，均達到安全、優質的效果。植物組織顯微結構圖像清晰，科研效果顯著。筆者簡明系統地介紹這一套低毒高效的植物石蠟切片方法，旨在為植物解剖學及其相關學科的應用研究與教學提供參考。

1 試劑的配制

1.1FAA固定液

將70%乙醇90mL、冰醋酸5mL、37%-40%甲醛（AR）5mL混合配成。

1.2阿拉伯樹膠粘貼劑

在滴瓶中裝入適量的蒸餾水，用解剖針挑取少量的阿拉伯樹膠粉輕輕彈入瓶內，然后振搖，使阿拉伯樹膠充分溶解；再挑取、彈入少量的阿拉伯樹膠粉，再振搖，直至阿拉伯樹膠不再溶解呈飽和狀態，最后加入一小顆粒重鉻酸鉀作防腐用（液體略呈微黃色），一般可保存數月。

1.3番紅和固綠染色劑

1.3.1番紅染色劑 將1g番紅溶于100mL的70%乙醇中即成。

1.3.2固綠染色劑 將0.5g固綠溶于100mL的95%乙醇中即成。

1.4封片劑

取一定數量的加拿大樹膠或中性樹膠于玻璃瓶中，用松節油為溶劑稀釋。松節油的用量可用玻璃棒確定。當用玻璃棒粘取混合液時，玻璃棒一端的混合液呈小滴滴下而不呈絲狀為宜。加拿大樹膠置于陰暗處存貯，避免樹膠變酸使切片變為棕黃色。

2 試驗方法

2.1取材、固定與番紅整體染色

選取正常生長植株的幼根、幼莖和向陽面成熟葉片。根、莖切成0.5-0.8cm長的小段，葉取中部沿葉脈兩側切成約0.4cm×0.8cm的小塊，置于FAA溶液中固定48h，然后轉到1%番紅/70%乙醇染色液中整體染色5-7天。

石蠟切片取材要適中。根和莖選取直徑為0.2cm左右大小為宜，直徑較大的要對徑切成小塊。葉片最好選取新梢的成熟葉，太嫩的發育不完全，太老的中脈易碎。用FAA固定后的材料可長時間保存。

2.2脫水、透明和石蠟包埋

用1%番紅/70%酒精整體染色的材料，可直接從85%乙醇開始逐級脫水，再用松節油透明。即85%-95%-無水乙醇-1：1無水乙醇與松節油混合液-松節油，每級1h，中間換液1次（即0.5h換液1次）。每次換液時，將液體緩緩倒出，用吸管吸去余液，并用卷筒紙擦干瓶口，盡量不讓余液留至下級。

材料經松節油透明后，進行透蠟和包埋。首先，在換上松節油的材料瓶中加入少許碎石蠟，待其慢慢溶化后再加，直至其不再溶化呈飽和狀態，如此在室溫下或28-32℃的電熱恒溫培養箱中浸蠟1-2天。然后，移到40℃的電熱恒溫培養箱中，掀開瓶塞讓松節油揮發，放置1h。爾后，把電熱恒溫培養箱溫度升高至52℃，將材料輕輕移入盛有1：1松節油與石蠟（熔）的小杯中，放置1h。此后，將電熱恒溫培養箱溫度調至65℃，同時在培養箱中放置2套純石蠟小杯；把材料輕移到其中1套純石蠟小杯中，放置1h后，再將材料輕移到另1套純石蠟小杯中，再放置1h。在純石蠟中透蠟2h即可包埋。

把先折好的紙盒放在溫臺上，將熔化的石蠟倒入寫有標簽的紙盒內，再用稍熱的鑷子把材料移入紙盒里、整理好，放置片刻。然后，輕輕提起紙盒兩把手，將紙盒慢慢平放在冷水中，使熔蠟立刻凝固成蠟塊。

2.3切片、脫蠟與固綠染色

將確定了切片方位的蠟塊修正（上、下切面平行且為上小下大的梯形），固定在堅硬的小木塊上。用切片機夾夾緊木塊，使蠟塊與刀口平行，然后進行切片。切片厚度以8-15μm為宜。選取好的蠟帶分切成小段，先在洗凈的載玻片上滴上阿拉伯樹膠-重鉻酸鉀粘貼劑，再用攝子輕輕將蠟帶貼在載玻片上，放于35-40℃的恒溫水浴鍋表面進行展片，用吸水紙吸去多余的水分，并用黑色簽字筆寫上標記（油性記號筆跡遇乙醇褪色，最好不用）。然后置于32-36℃的電熱恒溫培養箱中烘片24h，或自然風干。干燥后的切片用松節油脫蠟2遍，第1遍10-12min，第2遍5-8min，共15-20min。脫蠟完畢，即進入復水與固綠染色系列：1：1無水乙醇與松節油混合液-無水乙醇-0.5%固綠/95%乙醇染色液，每步停留2-3min。固綠染色停留時間最好鏡檢確定。即在染色1min時取出、放入95%乙醇中漂去浮色，在顯微鏡中觀察著色效果而增減時間。經番紅整體染色的材料紅色較深，固綠染色時間稍長，可以獲得很好的對染效果（圖1）。

2.4脫水、透明與封片

固綠染色之后，再繼續脫水和透明：95%乙醇-無水乙醇-1：1無水乙醇與松節油混合液-松節油（第1遍）-松節油（第2遍），每步約2-3min。最后用濃度適中的加拿大樹膠或中性樹膠封片，即在材料一邊滴上封片劑，沿著一邊輕輕蓋上蓋玻片。在載玻片上尚有松節油（未干）時進行封片，有利于封片劑擴散，少有氣泡。制片完成，稍干即可在顯微鏡下觀察和攝像。

3 討論

科研和教學實踐結果表明，采用該套改進的植物石蠟切片方法制片，用天然有機溶劑松節油代替二甲苯為透明與脫蠟劑，以阿拉伯樹膠為貼片劑，采用番紅整體染色、固綠分片染色有機相結合的優選雙重染色方法，再加以精簡和優化脫水、透明、透蠟等試驗操作流程?？杀苊舛妆降亩拘晕：?，減少環境污染；提高了勞動效率和制片質量，大量縮短試驗所需的時間。植物組織顯微結構圖像清晰（圖1），科研效果顯著。

3.1用松節油代替二甲苯為透明與脫蠟劑，以阿拉伯樹膠為貼片劑，在試劑上優化

松節油為天然有機溶劑，安全無毒，價格低廉；溶于乙醇亦為石蠟溶劑，透明能力強。早在1843年，瓦利（Varlev）就用松節油作整體組織的透明劑，1853年克拉克開始用于脊髓切片材料封片前的透明。由此可見，松節油作透明劑已有悠久的歷史。2005年筆者開始采用松節油代替常用的二甲苯為透明與脫蠟劑，2007年開始陸續在期刊上報道了應用這個改良方法的解剖試驗結果，2012—2013年還在《廣西動植物生態學研究》第二、三、四集發表了植物生態解剖學論文10余篇。長期的科研和教學實踐證明，用松節油為透明與脫蠟劑，其透明和脫蠟效果均較好，操作安全便捷，且效果穩定可靠性強，沒有二甲苯透明中容易發生的乳濁現象，還有效減少了有毒氣體對人體的危害及環境污染。雖然松節油的脫蠟效果比二甲苯稍慢，但脫蠟重復2遍，多花5-8min即可達到理想的效果。松節油的脫蠟效果與楊虎彪等的試驗結果相同。

阿拉伯樹膠為貼片劑，操作簡便快捷。其水溶液裝片與貼片一舉兩得，且初學者較易掌握。

3.2番紅整體染色和固綠分片染色相結合，在方法上優化

番紅在常規的石蠟切片中要在脫蠟后“復水”才染色。染色液常用70%以下低濃度乙醇或水配制，材料在溶液中浸泡時間長、移動次數多，極易從載玻片上脫落。本方法改進在材料固定后直接進行番紅整體染色，材料切片脫蠟后進行固綠染色。這樣免去了復水和脫水“95%乙醇-85%乙醇-70%乙醇-1%番紅/70%乙醇-70%乙醇-85%乙醇-95%乙醇”等一系列操作程序，大量減少了試驗時間、移動次數和掉片現象，而且材料著色較深，分色效果顯著，結構圖像清晰。同時材料整體染色還有利于在包埋、切片和選片中辨認和操作。

3.3精簡脫水、透明和透蠟等技術流程，在時間上優化

在傳統石蠟切片中，其脫水、透明和透蠟等技術流程各級停留時間均在2h以上，尚具有可簡化的操作空間。本方法改進為脫水、透明各級重復2遍，中間更換新溶液以保證試劑濃度，通常0.5h更換1次每級1h就可達到脫水或透明的效果。透蠟則改進為常溫浸蠟，減少高溫透蠟時間，提高試驗效率，并使工作程序更易操作。