一例引起史氏鱘魚創口感染的病原菌分離與鑒定

羅欽　羅土炎　饒秋華　涂杰峰

摘要：分離和鑒定引起史氏鱘魚創口感染的病原菌，為史氏鱘魚疾病防治提供科學依據。本實驗分析了一例剛捕獲的患有經微創手術后創口感染疾病的史氏鱘腐敗肉和肝臟的細菌菌相，分離獲得優勢菌株YSJ01，對優勢菌進行了形態學、藥物敏感性試驗、動物感染試驗和VITEK全自動微生物分析系統鑒定。結果顯示：菌株YSJ01為革蘭氏陽性菌；VITEK全自動微生物系統鑒定菌株YSJ01為致病性嗜水氣單胞菌；動物感染試驗證明：史氏鱘經創傷感染后表現為創口潰爛的典型癥狀；藥敏試驗結果表明：菌株YSJ01對氟苯尼考、復方新諾明、大觀霉素、利福平、強力霉素、卡那霉素等9種藥物敏感。對青霉素、氨芐西林、羧芐青霉素、萬古霉素、新生霉素、土霉素、萘啶酸、阿莫西林、林可霉素等表現出耐藥性。本研究為南方史氏鱘魚經微創手術后創口感染疾病的防治提供了重要的實驗依據。

關鍵詞：史氏鱘；嗜水氣單胞菌；分離與鑒定

中圖分類號：S941.42

文獻標志碼：A

論文編號：2013-0674

0 引言

史氏鱘是國家二級保護動物，由于外部特征不足以進行性別鑒別，因此人們通常采用穿刺技術進行鱘魚性別鑒別，但是穿刺手術后魚體留下了一條約1cm寬、5cm深的創口，魚體局部免疫系統被打破，抵抗力下降，而且史氏鱘生活在水環境中，創口愈合一般比陸生動物慢，容易造成外科感染，引發鱘魚慢性炎癥甚至死亡，陳細華等利用外科手術對中華鱘進行性別鑒定時發生3尾死亡，由于死因不明，故也存在由于手術后造成死亡的可能，因此對創口感染病原菌的分離與鑒定，可為創口感染疾病的治療和預防提供科學依據，防止鱘魚創口感染疾病的發生和傳染，從而降低企業養殖風險，對提高鱘魚養殖業的成活率具有重要經濟效益。傷口是病原菌的入口，霉菌侵入魚體傷口引發水霉病已經在鱘魚、黃顙魚、鯉魚、河豚、黃鱔、泥鰍等淡水魚類和觀賞魚類中進行了大量的研究報道；劉振勇等2005年進行了溶藻酸弧菌病病原菌入侵大黃魚傷口引發感染疾病的研究；馬國文等1999年進行了嗜水氣單胞菌入侵鯉魚傷口引發感染疾病的研究，詳細研究了病原與病理，是國內進行了嗜水氣單胞菌對魚體創口研究較深入的一篇論文。嗜水氣單胞菌對史氏鱘魚體創口感染的研究尚未見報道，史氏鱘屬于冷水性魚類，由于史氏鱘人工養殖主要在南方，南方夏季水溫高可達30℃左右，而且持續時間長，導致史氏鱘自身免疫力下降，而嗜水氣單胞菌是養殖及野生魚、蝦、蛙、甲魚等生物常見的細菌性病原體，可通過受傷的皮膚及傷口感染，其生長繁殖最適的pH6.5-7.5、水溫為30℃左右，因此史氏鱘經穿刺手術后創口極容易在高溫季節受到嗜水氣單胞菌的入侵從而引發感染疾病。2013年8月，福建省寧德市一史氏鱘魚養殖場發現一尾經微創手術后創口感染疾病的史氏鱘魚，該魚的創口處具有明顯潰瘍的癥狀。因此本研究擬從患有創口感染疾病的史氏鱘腐敗肉和肝臟分離出優勢菌株，并對其進行了形態特征、藥物敏感性試驗、動物感染試驗和VITEK全自動微生物分析系統鑒定等研究，以期確定該病的致病菌，從而為該病的治療和預防提供科學依據。

1 材料與方法

1.1樣品采集

1.1.1病料采樣 將微創手術后創口感染的史氏鱘取出，立即放入冰水中浸浴5min進行冷休克，然后倒去冰水，將魚至于層冰上，采用隔熱泡沫箱保持魚體溫度在0-4℃，并于5h內運往實驗室分析檢驗。

1.1.2健康魚采樣 活的低齡史氏鱘取自福建省某史氏鱘魚養殖場，選擇健康活魚15尾，每尾重800-1200g，立即放入冰水中浸浴5min進行冷休克，然后倒去冰水，將魚至于層冰上，采用隔熱泡沫箱保持魚體溫度在0～4℃，并于5h內運往實驗室水族箱養殖，進行人工感染試驗。

1.2微生物取樣

將患穿刺創口感染癥狀的史氏鱘用無菌水沖洗干凈，置潔凈托盤中，取創口一側帶潰瘍的皮膚和肌肉，放入組織搗碎機攪碎，取25g于225mL無菌生理鹽水中。

1.3試驗方法

1.3.1病原分離及形態鑒定 取病魚，用無菌生理鹽水沖洗病魚體表，在無菌條件下，用接種環分別挑取病魚潰爛灶邊緣的肌肉和肝臟接種于TSB肉湯；將接種后的TSB肉湯放入水浴振蕩器中120r/min、30℃下培養24h后觀察細菌生長狀況，然后將帶菌肉湯在應用瓊脂固體培養基上劃線培養，30℃下培養24h后肉眼觀察菌落特征完全相同的菌落，并計數，數量最多的菌株作為優勢菌，挑取形態特征一致的優勢單菌落，劃線LB平板進行純培養。

1.3.2藥敏試驗 采用K-B紙片法。挑取單菌落，接種營養肉湯，28℃震蕩培養24h，形成均一渾濁狀。用生理鹽水將菌液濃度稀釋至1×10⁷-1×10⁸cfu/mL，均勻地將待檢測的菌液涂布瓊脂平板中，用無菌鑷子貼上藥敏片，30℃培養24h，觀察其抑菌圈的有無及直徑大小。根據抑菌圈直徑判斷標準判斷菌株對藥物的敏感性結果（抑菌圈越大表明敏感性越強），記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑。

1.3.3動物感染試驗 挑取營養瓊脂固體培養基上的單個菌落接種于蛋白胨液體培養基中，搖床150min、30℃培養24h，將菌懸液稀釋為3×10⁸cfu/mL。選擇體表無傷痕、活力強的史氏鱘各五尾分為試驗組和對照組，將魚各置于2個水族箱中，充氣飼養，日換水1次，早、晚各投喂1次配合飼料。暫養7天后，采用創傷感染，即將試驗魚體表劃開一個口，穿刺，然后浸泡在細菌懸液中，對照組浸泡于無菌生理鹽水中。每日定時投餌和換水并做好記錄，再按照1.3.1的試驗方法，進行細菌分離。以引起試驗史氏鱘創口發生感染癥狀并能重新分離回收到原感染菌作為分離菌致病性的判定標準。

1.3.4生化鑒定試驗 取純化的菌懸液，稀釋到一定的濁度，根據革蘭氏染色結果，采用法國梅里埃公司生產的VITEK 2全自動生化分析儀進行細菌類型鑒定試驗。

2 結果與分析

2.1分離菌培養及形態特性

經劃線分離細菌后，在LB培養基上可得大量圓形、表面光滑、中央隆起、不透明、直徑1.5mm、灰白色的優勢生長菌落。將該菌命名為YSJ01。

2.2藥敏試驗

分離菌株YSJ01對18種藥敏片的結果見表1。

由試驗結果得知：菌株YSJ01對卡那霉素、強力霉素、氟苯尼考、大觀霉素、鏈霉素、紅霉素、氧氟沙星、復方新諾明、諾氟沙星等9種藥物敏感。對林可霉素、青霉素、新生霉素、氨芐西林、土霉素、羧芐青霉素、阿莫西林、萬古霉素、萘啶酸等9種藥物不敏感，表現出耐藥性。

2.3動物感染試驗

通過創傷感染方式對健康史氏鱘魚進行人工感染，結果發現：人工感染36h后開始逐漸出現創口潰瘍癥狀，48h后創口變大而且潰爛嚴重，試驗組病魚表現典型的與自然發病一致的癥狀，而對照組一周內未見明顯病癥，活動正常。在無菌條件下，從人工感染發病的史氏鱘魚病灶周圍肌肉和肝臟中分離到YSJ01-R優勢菌株，經細菌學鑒定，菌YSJ01-R和YSJ01菌的生物學特性一致為同一種。由于對照組正常，表明YSJ01菌株是史氏鱘魚穿刺引起感染的致病菌病原。

2.4生化鑒定

本研究采用64孔的革蘭陰性菌鑒定卡（GN），經VITEK2全自動生化分析儀檢測后，檢測結果見表3。儀器檢測結果顯示分離菌YSJ01為嗜水氣單胞菌的概率為98%，達到了ID信息置信水平為極好水平，因此，綜合各方面試驗結果，可將分離菌YSJ01鑒定為嗜水氣單胞菌。

3 結論

嗜水氣單胞菌是史氏鱘魚在福建省高水溫季節經微創手術后引起感染的主要致病菌。史氏鱘魚經過人工創傷感染本嗜水氣單胞菌后，36h開始逐漸出現創口潰瘍癥狀，48h創口變大而且潰爛嚴重，試驗組病魚表現典型的與自然發病一致的癥狀；本嗜水氣單胞菌經過藥敏試驗后表明其對氟苯尼考、復方新諾明、大觀霉素、利福平、強力霉素、卡那霉素等9種藥物敏感；對青霉素、氨芐西林、羧芐青霉素、萬古霉素、新生霉素、土霉素、萘啶酸、阿莫西林、林可霉素等表現出耐藥性。本研究首次確定了在福建省高水溫季節引起史氏鱘創口感染的病原菌是嗜水氣單胞菌，而不是由冬春季節常見的霉菌或嗜鹽性溶藻酸弧菌引起，這可能是由于嗜水氣單胞菌為條件致病菌，本研究病料所在的福建省寧德市史氏鱘魚養殖場，使用了大庫容水庫下游的淡水，當時的水溫為30℃和pH7.5，這是嗜水氣單胞菌生長繁殖最合適的水溫和pH，從而導致史氏鱘創口被嗜水氣單胞菌感染。

4 討論

4.1本史氏鱘感染嗜水氣單胞菌的原因

史氏鱘自身修復能力強，經外科微創手術后20天左右開始攝食，傷口完全愈合，因而由穿刺引起史氏鱘創口感染的研究未見報道。但本研究發現了一尾史氏鱘魚，并經過病原菌的分離和鑒定后確定致病菌為嗜水氣單胞菌，這可能是由于該史氏鱘體質比一般史氏鱘弱小，四齡魚體重才2.5kg，而且當時養殖水體pH7.5，水溫為30.0℃，在此條件時史氏鱘魚自身免疫力下降嚴重，而嗜水氣單胞菌卻處于最適宜的生長繁殖環境中，由于同池中有發現頭部嚴重潰爛的鱘魚，經檢測后發現頭部潰爛的鱘魚病原是嗜水氣單胞菌，這與張玉貴等對雜交鱘體表潰瘍病鑒定的病原一致，因此本史氏鱘可能是由于自身免疫力差，接觸了頭部潰爛的鱘魚后，導致其傷口受到嗜水氣單胞菌感染，引發潰瘍。因此對于經過穿刺后的史氏鱘魚，應與患有皮膚潰瘍等疾病的鱘魚隔離養殖，防止穿刺后的鱘魚受到感染，特別是高水溫季節更應注意。

4.2本史氏鱘未感染水酶菌的原因

本史氏鱘魚養殖場位于福建省寧德市，養殖水為大庫容水庫下游的水，水溫在冬春季節可維持在12℃～18℃之間，此時的水溫容易引發水霉病，但是本史氏鱘魚養殖場未發現經外科微創手術后創口感染的病料，這可能是由于史氏鱘魚為冷水性魚類，在低溫季節其自身免疫力強，再加上鱘魚場養殖技術人員擁有十幾年的鱘魚養殖經驗，對常見的水霉病具有很好的防治方法，從而導致在冬春季節未出現病料，而在高水溫季節，由于史氏鱘自身免疫力下降和嗜水氣單胞菌防治技術不完善，會出現病料。

4.3本史氏鱘未感染溶藻酸弧菌的原因

溶藻酸弧菌屬專性嗜鹽性弧菌，主要存在于海水中，海產品的染菌率較高，而史氏鱘魚屬于淡水魚類，為非海棲性的洄游鱘魚，這與中華鱘不同，因而史氏鱘魚在養殖過程中不需使用海水，從而不易受溶藻酸弧菌的感染。