ABA和PP₃₃對國蘭低溫脅迫及恢復中光合作用和葉綠素熒光參數的影響

于永暢　張林　王厚新　李承秀　牛田　顏婷美　王長憲

摘要：為探討植物生長調節劑ABA和PP₃₃對國蘭低溫脅迫下抗寒性的影響，以春蘭名品‘宋梅為試材，采用20mg/LABA和300mg/L PP₃₃對‘宋梅幼苗葉片進行葉面噴施和灌根處理，于光照培養箱[晝溫/夜溫=（5±0.5）℃/（0±0.5）℃]中進行低溫脅迫9天，然后轉入正常條件[晝溫/夜溫=（22±0.5）℃/（15±0.5）℃]恢復12天，研究不同低溫處理及恢復時間對國蘭光合作用和葉綠素熒光參數的影響。結果表明：低溫導致春蘭幼苗葉片的葉綠素含量、葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、氣孔限制值（Ls）、PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、光化學猝滅系數（qP）、光合電子傳遞量子效率（φPSⅡ）、光適應下最大光化學效率（Fv'/Fm'）、光合電子傳遞速率（ETR）和光化學耗散能量（Prate）下降，胞間CO₂濃度（C1）、初始熒光（F₀）和天線熱耗散速率（Drate）則逐步上升，經ABA和PP₃₃處理的植株指標波動幅度低于清水處理的植株，脅迫解除后能迅速恢復到對照水平，說明低溫脅迫直接損傷光合機構使PSⅡ反應中心失活，而ABA和PP₃₃可緩解PSⅡ反應中心受到的傷害，維持較高的光能捕捉能力和同化率，保證春蘭幼苗葉片的光合作用能力。

關鍵詞：春蘭；抗寒性；光合作用；葉綠素熒光

中圖分類號：S688

文獻標志碼：A

論文編號：2013-0754

0 引言

低溫傷害是植物生長過程中常見的自然災害，也是植物區域性分布和季節性生長的限制因素，它不僅導致植物產量的降低，嚴重時還會造成植株死亡。目前，在引種和培育抗寒品種過程中，評價植物抗寒性的常用方法是電導法、組織褐變法和2，3，5-氯化三苯基四氮唑還原法。近年來，有關光合和葉綠素熒光技術在植物抗逆性的研究領域逐漸增多，在植物抗寒性方面也顯示出良好的應用前景。

蘭花是中國十大傳統名花之一，距今已有2500多年的栽培歷史，國蘭以其層出不窮的花藝、變幻莫測的葉藝受到愛花之士的喜愛。但是在日光溫室國蘭冬春季生產中，雨雪天氣較多，溫室內的蘭花常處于低溫的環境中，即白天溫度常低于20℃、夜間溫度常低于5℃。而蘭花性喜溫暖氣候，一般國蘭的生長適溫為15-25℃，溫度低于10℃生長緩慢，0℃低溫便會造成不同程度的凍害發生，低溫危害成為制約國蘭在北方地區栽培生長的重要限制因素。通過一些途徑提高植物的抗寒性，對于避免和減少植物寒害損失有重要意義。

植物抗逆化學誘導指的是利用外源化學物質模擬逆境信號或作為植物逆境信號傳導過程中的中間信號物質，誘發植物啟動抗性機制。植物激素在提高植物抗低溫和微管抗冷穩定性方面有重要的作用，是植物抗寒基因表達的啟動因子之一，同時外施植物激素類物質也能增強植物的抗寒性。內源脫落酸（ABA）是植物的“抗逆誘導因子”，誘導植物產生對不良生長環境的抗性。一般認為，ABA能提高植物的抗寒性，可能在于它能增強植物細胞保護系統的功能，提高細胞清除活性氧的能力，防止膜脂過氧化及穩定細胞膜結構，同時啟動植物冷誘導基因的表達，提高植物抗寒性，脫落酸在植物抗寒性方面所起的作用已在葡萄、小麥等多種作物中得到證實。多效唑（PP₃₃₃）也可提高多種植物的抗逆性，原因可能是多效唑可抑制植物體內赤霉素的合成，降低內源吲哚乙酸水平，提高吲哚乙酸氧化酶活性，增加細胞膜的穩定性，從而提高植物的抗逆性。目前，有關光合和葉綠素熒光機理在植物抗寒性方面的研究僅在黃瓜、水稻、番茄等少數作物上有相關報道，對于經過抗性處理的植物在低溫脅迫下光合特性變化的研究較少，尤其在國蘭方面尚未見相關報道。

光合作用是植物最基本的生命活動，低溫脅迫不僅降低了葉綠體基質中進行的光合作用暗反應活性，還會引起類囊體膜介導的光反應活性降低，從而降低類囊體膜上的PS Ⅱ的光能傳遞效率和光能轉換效率，導致CO₂同化力降低，直接影響光合機構的性能和活性。光合機構中葉綠素吸收的光能主要有3個可能去向，即推動光合作用、轉變成熱散失和以熒光形式發射出來，由于這三者間存在此消彼長的關系，因此，通過熒光變化可以探測出光合作用和熱耗散情況，逆境因子對植物光合作用的影響也可以通過它反映出來。本試驗以春蘭名品‘宋梅為試材，通過測定低溫脅迫下經ABA和PP₃₃₃處理的春蘭幼苗光合作用和葉綠素熒光參數的變化，探討低溫脅迫對國蘭光合機構的影響及ABA和PP₃₃₃在提高國蘭抗寒性方面的作用，為國蘭在中國北方地區的選育栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料及處理

試驗于2012年10月-2013年2月在泰山林業科學研究院設施園藝中心和山東農業大學花卉研究室進行，供試材料為泰山林業科學研究院選育的春蘭名品‘宋梅1年生幼苗。將蘭花幼苗定植于裝有植蘭寶的花盆中，在日光溫室中進行培養，當株高長至20cm左右，挑選生長健壯、長勢一致的植株，用脫落酸（ABA，購白天津凱通化學試劑有限公司，為國產分析純）、多效唑（PP₃₃₃，購白天津凱通化學試劑有限公司，為國產分析純）進行葉面噴施和灌根處理，ABA處理濃度為20mg/L、PP₃₃₃處理濃度為300mg/L（前期試驗發現20mg/L ABA和300mg/L PP₃₃₃對提高國蘭抗寒性方面具有顯著影響）。采用隨機區組設計，設3次重復，每小區10盆。為提高植株對生長調節劑的吸收效果，在第1次噴施后10天再進行第2次噴施，每次噴施以葉面附帶小液珠為準，水肥管理按蕙蘭的正常管理進行，共噴施5次。

處理完成后，將上述材料移入人工氣候室，在晝溫/夜溫[（22±0.5）℃/（15±0.5）℃]適應2天，測定各參數值作為初始值，然后進行晝溫/夜溫[（5±0.5）℃/（0±0.5）℃]低溫脅迫處理，光照時間為14h，光強為3000lx，相對濕度為80%。低溫脅迫9天后轉入晝溫/夜溫[（22±0.5）℃/（15±0.5）℃]中進行恢復生長，選取植株葉片的中上部，在低溫脅迫處理后的第3、5、7、9天及恢復處理后的第3、6、9、12天測定植物葉片葉綠素含量及光合、熒光參數，以晝溫/夜溫[（22±0.5）℃/（15±0.5）℃]處理為CK，每項指標測定3株，3次重復。

1.2測定指標及方法

1.2.1葉綠素含量的測定 采用丙酮法測定葉綠素含量，稱取葉片0.5g于研缽內，加入少量CaCO₃和5mL80%的丙酮，將材料充分研磨細碎直至變白，轉移至10mL具塞離心管中，定容至刻度，搖勻后置于4℃冰箱中靜置12h，離心10min（2000r/min），取上清液在波長663、645和652mm下測定吸光度，以80%丙酮為空白對照，計算葉綠素a、b含量和葉綠素總量。

1.2.2光合參數的測定 選擇健康葉片的中上部并做標記，采用英國PP-Systems公司產CIRAS-1型便攜式光合測定儀測定凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和胞間CO₂濃度（C1）。測定時設置內置光源光合有效輻射為500μmol/（m²·s），CO₂濃度為400μmol/mol，溫度為25℃，每日9：00-11：00進行測定。

1.2.3葉綠素熒光參數的測定 采用英國Hansatech公司生產的FMS-2型便攜式調制熒光儀測定各項熒光參數，測定時間、葉片部位與光合作用相同。測定前先暗適應30min，然后照射檢驗光[<0.05μmol/（m²·s）]測定葉片的初始熒光（F₀），再用飽和白光[7200μmol/（m²·s）]照1s測最大熒光（Fm）及光適應[500μmol/（m²·s）]下的穩態熒光（Fs）、初始熒光（F₀'）、最大熒光（Fm'）。根據儀器測定的參數值和Adams等和Schreiber等的方法，結合式（1）～（7）計算各參數。

1.3數據處理

采用Microsoft Excel進行數據處理和制圖，采用DPS 7.05軟件的LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1ABA、PP₃₃₃處理在低溫脅迫及恢復中對葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，其含量的多少直接影響植物的生長。在本試驗中，‘宋梅幼苗的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量均隨低溫脅迫時間的延長而降低（圖1）。低溫脅迫下，各處理間葉綠素含量下降趨勢不同，經ABA和PP₃₃₃處理的幼苗葉綠素含量緩慢降低，而清水處理的幼苗葉綠素含量急劇下降，說明此低溫下清水處理的幼苗受到的傷害較為嚴重。ABA處理和PP₃₃₃處理比較，在脅迫初期（3～5天），經ABA處理的葉片葉綠素含量高于經PP₃₃₃處理的葉片葉綠素含量，隨脅迫時間的進一步延長（5～9天），經PP₃₃₃處理的葉片葉綠素含量反而高于經ABA處理的葉片葉綠素含量，原因可能是不同植物激素對植物產生作用的條件不同。低溫處理9天后，各處理的葉片葉綠素含量均降到了最低，葉綠素a含量分別降低了32.34%、32.83%、33.08%；葉綠素b含量分別降低了23.43%、23.65%、32.82%；葉綠素總量分別降低了29.33%、29.49%、32.99%。在恢復階段，經ABA和PP₃₃₃處理的植株葉片葉綠素含量恢復速度明顯高于清水處理的葉片，在處理后的第21天（即恢復處理第12天），經ABA處理的葉片葉綠素a、b、a+b含量分別恢復到了對照的91.41%、86.19%、89.66%；經PP₃₃₃處理的葉片葉綠素a、b、a+b含量分別恢復到了對照的86.19%、84.22%、77.46%清水處理的葉片葉綠素a、b、a+b含量分別恢復到了對照的89.66%、88.57%、85.75%。可見，經ABA和PP₃₃₃處理后植株受到的低溫傷害要小于清水處理，說明ABA和PP₃₃₃處理可以提高植株的抗寒性。

2.2ABA、PP₃₃₃處理在低溫脅迫及恢復中對光合參數的影響

凈光合速率是植物光合系統工作正常與否的重要指標。低溫脅迫處理均降低了‘宋梅葉片的凈光合速率（Pn），其中低溫處理9天后的凈光合速率降低最明顯（圖2A），ABA、PP₃₃₃和清水處理的植株凈光合速率與對照相比分別降低了53.12%、59.37%、62.5%，說明低溫脅迫對春蘭的光合系統功能產生了嚴重破壞。進入恢復期后凈光合速率逐漸恢復，其中PP₃₃₃處理的植株恢復最快，恢復12天后為對照的68.57%，而ABA和清水處理恢復到了對照的62.85%和54.28%。葉片的氣孔導度和細胞間隙CO₂濃度是影響光合速率的重要因素。本試驗中，‘宋梅幼苗的氣孔導度（Gs）隨處理溫度的降低而下降（圖2B），其中低溫處理9天后降幅最大，ABA、PP₃₃₃和清水處理的植株氣孔導度與對照相比分別降低了60.31%、61.91%、65.08%。而各處理的細胞間隙CO₂濃度（Ci，圖2C）都逐漸上升，與氣孔限制值（Ls，圖2D）呈相反的變化趨勢。清水處理植株的Pn、Gs和Ls始終低于ABA和PP₃₃₃處理，且均遠低于對照。轉入恢復條件后，各處理的Pn、Gs和Ls均開始回升，而Gi則降低。說明ABA和PP₃₃₃處理對增強低溫脅迫下‘宋梅的光合作用具有重要作用。

2.3ABA、PP₃₃₃處理在低溫脅迫及恢復中對葉綠素熒光參數的影響

初始熒光（F₀）是PS Ⅱ反應中心處于完全開放時的熒光產量，它反映了PS Ⅱ天線色素受激發后的電子密度，與葉片的葉綠素濃度有關。Fv/Fm是PSⅡ最大光化學效率，其變化程度可以用來鑒別植物抵抗逆境脅迫的能力。在本試驗中，各處理植株F₀隨著低溫脅迫時間的延長而上升，Fv/Fm則逐步遞減（圖3）。ABA和PP₃₃₃處理的植株在處理和恢復過程中F₀和Fv/Fm波動較小，而清水處理的植株的F₀則明顯上升，Fv/Fm顯著下降，且隨著脅迫時間的延長，相鄰處理時間之間升高或降低的幅度越大，低溫脅迫第9天時F₀較對照升高了44.15%，Fv/Fm較對照降低了55.24%，ABA和PP₃₃₃處理的植株F₀較對照分別升高了29.87%和11.95%，Fv/Fm較對照分別降低了11.95%和9.51%。表明低溫對PSⅡ反應中心造成了傷害，使其光能轉化能力顯著下降，導致了春蘭幼苗葉片光合能力的降低，而經ABA和PP₃₃₃處理的植株受傷害程度低于清水處理的植株，說明ABA和PP₃₃₃處理對提高春蘭幼苗的抗寒能力具有一定的作用。在溫度恢復階段，恢復9天后基本接近對照水平，說明該傷害可在一定時間能得到修復，屬于可逆損害。

春蘭葉片的qP、φPSⅡ和Fv'/Fm'均隨低溫脅迫時間的延長顯著降低。處理9天時，ABA、PP₃₃₃和清水處理的植株qP與對照相比分別降低了53.7%、50%和70.37%，φPSⅡ與對照相比分別降低了82.75%、75.86%和89.65%，Fv'/Fm'與對照相比分別降低了58.49%、50.94%和69.81%。ABA和PP₃₃₃處理植株的qP、φPSⅡ和Fv'/Fm'的下降幅度始終小于清水處理植株的下降幅度，且恢復處理后迅速恢復到對照水平，恢復12天后ABA和PP₃₃₃處理基本恢復到了對照水平，而清水處理仍顯著低于對照，說明低溫脅迫對經ABA和PP₃₃₃處理的植株未造成嚴重傷害，而導致了未處理的植株光合機構的部分失活或破壞。

低溫脅迫處理顯著降低了春蘭葉片的光合電子傳遞速率（ETR）和光化學耗散能量（Prate），提高了天線熱耗散速率（Drate）。處理9天時，ABA、PP₃₃₃和清水處理的植株ETR分別降低了81.93%、75.98%和91.11%，ABA和PP₃₃₃處理的植株在脅迫初期下降幅度較小，第3天開始才明顯下降，恢復13天后達到對照水平的78.21%和79.41%，而此時清水處理的植株僅恢復到對照水平的55.09%，說明低溫脅迫對未作處理的植株造成的傷害較大，導致了部分光合機構的失活或破壞。而處理9天時，ABA、PP₃₃₃和清水處理的植株Prate分別為對照的18.61%、24.01%和8.32%，Drate分別比對照升高了65.95%、57.44%和78.72%。恢復處理后，各處理Prate仍低于對照水平，說明低溫脅迫已對植物的光合機構造成了破壞，ABA和PP₃₃₃處理的植株相比清水處理的植株受傷害較輕，說明ABA和PP₃₃₃處理對提高春蘭的抗寒性具有一定作用。

3 結論與討論

低溫脅迫使植物產生大量的自由基，損傷膜系統，最終造成低溫傷害。應用植物生長調節劑改善植物抗寒性，保護植物免受低溫傷害，是簡便易行、經濟適應的一種方法。植物體內的保護系統有2類：一是酶促系統，包括過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等；二是非酶促系統，包括游離脯氨酸（Pro）、可溶性糖等。因此，對抗寒性的評價必須是多方面的。植物生長調節劑在提高植物抗寒性方面多有報道，但多集中于大田作物，對提高觀賞植物抗寒性方面未見報道。

光合作用是植物受低溫影響最明顯的生理過程之一。當春蘭幼苗受到低溫脅迫時，葉綠體結構受到嚴重破壞。本試驗中，低溫脅迫處理9天后，ABA、PP₃₃₃和清水處理的植株葉片葉綠素a含量分別降低了32.34%、32.83%、33.08%；葉綠素b含量分別降低了23.43%、23.65%、32.82%；葉綠素總量分別降低了29.33%、29.49%、32.99%。可見，低溫脅迫造成了葉綠素含量的普遍降低，但清水處理的幼苗葉綠素含量始終低于經ABA和PP₃₃₃處理的幼苗，說明ABA和PP₃₃₃對保護葉綠體結構起到了一定作用。

通常認為逆境脅迫導致植物凈光合速率（Pn）下降的原因主要包括氣孔因素和非氣孔因素。本研究中，隨著低溫脅迫時間的延長，春蘭葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）和氣孔限制值（Ls）均明顯降低，細胞間隙CO₂濃度（C1）上升，說明低溫脅迫下春蘭葉片凈光合速率的降低不是由于氣孔導度下降導致的CO₂供應量減少，而是由于非氣孔因素阻礙了CO₂的利用，導致了細胞間隙CO₂的積累。

低溫環境中的葉片受光可導致光合細胞器的受損，這種現象就是光合作用中的光抑制。光抑制啟動了活性氧的誘導，這個過程可能會導致光合系統的退化，類囊體膜的膜脂過氧化，以及碳代謝過程中酶的失活。大量研究表明，植物體內的ABA在低溫下所起的作用很重要，Chen等研究后提出假設，冷馴化是由ABA的作用啟動的，外源施用ABA可以增加某些經過冷馴化植物種類的抗寒性。

低溫脅迫對植物光合作用的影響是多方面的，葉綠素熒光測定技術被認為是探知植物體內生理狀態與環境變化的理想探針，通過熒光變化可以探測光合作用和熱耗散情況。F₀是經暗適應的光合機構PS Ⅱ反應中心完全開放時的熒光強度，它與激發光的強度和葉綠素濃度有光，而與光合作用的光反應無關，Fv/Fm反映了PSⅡ反應中心的最大光能轉換效率，在非脅迫條件下，Fv/Fm的變化極小，但在逆境條件下，植物受到脅迫或其他原因猝滅了熒光，這一效率值則會明顯下降。在本試驗中，隨著低溫脅迫時間的延長，各處理均造成了F₀的升高和Fv/Fm的降低，原因應該是低溫使植物受到了光抑制且導致了PS Ⅱ反應中心的失活或破壞。而經ABA和PP₃₃₃處理的植株F₀和Fv/Fm變化不大，這表明此時的低溫脅迫并未對其造成明顯的光抑制，而清水處理的植株F₀和Fv/Fm變化較大，原因可能是低溫嚴重抑制了植物葉片的碳同化能力，并使光能過剩，導致低溫光抑制，這與Fracheboud在抗寒小麥品種中的研究相似。在恢復階段，ABA和PP₃₃₃處理植株的F₀和Fv/Fm在第21天基本恢復到了對照水平，可見此條件并未造成PS Ⅱ反應中心的損害，只是低溫下的可逆性失活。Fv'/Fm'在低溫脅迫階段一直處于下降趨勢，說明低溫處理下蘭花葉片的PS Ⅱ反應中心隨脅迫時間的延長而逐漸關閉，天線色素光能傳遞效率下降，這可能是植物為防止過剩光能破壞光合機構而形成的一種保護性機制。qP反映的是光能中用于光化學反應的部分，反映了光合活性的高低，φPSⅡ反映了光合電子傳遞量子效率的強弱。本試驗中，各處理的Fv'/Fm'、qP、φPSⅡ和ETR均隨低溫脅迫時間的延長呈下降趨勢，說明低溫造成了PSⅡ活性中心的潛在活性和原初光能轉換效率的減弱，使光合電子傳遞受阻，抑制為光合碳同化提供ATP和NADPH，引起碳同化降低，從而影響了蘭花正常的光合作用。但經ABA和PP₃₃₃處理的植株下降幅度較低，保持了較高的Fv'/Fm'、qP、φPSⅡ和ETR值，說明ABA和PPP₃₃₃處理提高了春蘭低溫下對光抑制的抗性，這與劉鵬在冷鍛煉甜椒品種葉綠素熒光中的研究結果相似，可以說ABA和PP₃₃₃處理相當于對春蘭進行了冷鍛煉。本試驗觀察到，低溫下春蘭分配于光化學反應的能量減少，分配于天線耗散的能量增加，說明低溫脅迫下春蘭光合速率下降的同時，光合機構的過剩激發能增多，在光化學反應耗能減少的情況下，天線系統的熱耗散增加，但經ABA和PP₃₃₃處理的春蘭光反應中心在低溫下受到的傷害小，光化學效率高，分配于天線系統的能量耗散少。

植物的抗寒性在生理生化方面的表現，最終由植物體基因表達來控制，所以基因方面的研究有利于從根本上改善植物的抗寒性。春蘭幼苗葉片PS Ⅱ反應中心是否存在不可逆失活，哪些植物生長調節劑能夠啟動植物的冷馴化，如何對環境低溫做出應答以及植物周圍的環境信號對植物抗寒性的影響，都是今后植物抗寒性的熱點，有待于進一步研究。