利用SRAP標記對牡丹雜交親和性的分析

孫逢毅 李玲 石良紅 趙蘭勇

摘要：為了探究不同雜交組合結實率與親本親緣關系之間的聯系，了解牡丹雜交親和性的影響因素，以16個牡丹品種為試材，進行雜交試驗。并利用SRAP分子標記技術分析品種間親緣關系。結果表明，雜交親本的相似系數在0.31~0.35時結實率較高。針對實際育種目標，提出了牡丹親本搭配策略，在保證滿足育種要求的前提下，為獲得更多的雜交種子。應盡量選擇親緣關系稍遠的品種形成雜交組合。

關鍵詞：牡丹；親緣關系；結實率；親本搭配

中圖分類號：S685.11文獻標志碼：A論文編號：2013-0897

0引言

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia L.)落葉灌木[1-2]，是中國的傳統名花，牡丹育種一直受到國內外高度重視。要想獲得更多不同類型的牡丹品種，需要進行定向育種，這方面在中國研究非常欠缺。相關序列擴增多態性SRAP標記是由美國加州大學蔬菜作物系Li and Quiros[3]提出。該標記多態性高、重復性好、操作簡單、沒有物種特異性，引物較ISSR更具隨機性[4]。現已廣泛應用于種質鑒定[5]、圖譜構建[6-7]、比較基因組學[8]和遺傳多樣性分析[9]。牡丹方面，如Han等[10]利用SRAP技術分析中國牡丹品種‘洛陽紅、‘二喬與日本牡丹品種‘太陽、‘島錦間的差異；王娟等[11]利用SRAP技術對20個牡丹品種進行基因組DNA多態性分析。但目前還沒有利用分子技術探究牡丹雜交親和性的相關報道。因此，筆者利用SRAP標記技術分析牡丹16個品種的親緣關系，進而探討不同雜交組合結實率與親本親緣關系之間的聯系，為科學選擇親和性高的雜交親本提供依據。

1材料與方法

1.1試驗時間、地點

研究田間試驗于2013年在山東農業大學林學試驗站進行，室內試驗在山東農業大學花卉研究所進行。

1.2試驗材料

以牡丹品種‘清香白、‘迎日紅、‘朱砂壘、‘黑海撒金、‘鳳丹白‘雪蓮等16個品種作試驗材料，于2013年4月13日采樣，均選取幼葉，硅膠干燥后置于4℃冰箱貯存備用，5月中旬在提取DNA并進行測定。

1.3試驗方法

1.3.1雜交育種及結實數的統計選擇正常生長的植株，每株保留3朵花（大小一致），選上部花，露色后及時去雄套袋。上午8:00—10:00進行人工授粉。選擇即將在當日展開的花，撥開花瓣（盡量不損傷花瓣），用鑷子輕輕將雄蕊去除，立刻授以干燥的花粉，并套袋掛牌，約1周后子房膨大。8月初當果實變為蟹黃色且微裂時采集，攤放在室內，種子自動脫出，統計種子數量。

1.3.2基因組DNA提取采用CTAB法提取基因組DNA[12]，紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和濃度，并稀釋至25 ng/μL，保存于-20℃備用。

1.3.3SRAP-PCR分析SRAP反應體系參照Li與Quiros[2]，每25 μL的PCR反應體系中，含10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，5 μmol/L引物1.5 μL，模板2 μL，ddH2O補充至25 μL。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行5個循環；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行30個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物采用4%聚丙烯酰胺凝膠儲液配制分離，用DG-II暗箱式紫外透箱儀觀察拍照。

1.3.4數據分析用ABI377測序儀電泳檢測后的片段大小即為原始數據。在原始數據的基礎上，有帶的地方替換為1，無帶的地方替換為0，這樣構成了01數據。數據是通過GENESCAN軟件進行分析，軟件每2個堿基讀1次數，Marker片段范圍為 70~500 bp，這樣在70~500 bp之間一共讀取216個數。用POPGENE 1.32和NTSYS-pc version 2.1軟件對各材料間的遺傳相似系數等進行分析；根據遺傳相似系數采用UPGMA法進行聚類分析并構建樹狀圖。

2結果與分析

2.1SRAP擴增產物的多態性

SRAP引物參照蘇美和[13]的方法由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成，堿基序列見表1，用4份材料對64對SRAP引物進行篩選，共得到9對擴增穩定、條帶清晰、多態性好的引物。9對引物從16份材料基因組DNA中擴增處的結果顯示，共擴增出1344個位點，其中1330個為多態性位點，占98.95%，平均每對149.3個，多態性位點最多的引物組合為ME5-EM3，達到185個。引物組合ME2-EM2擴增的多態性位點最少為120個。引物對ME5-EM3擴增結果如圖1所示。

2.2聚類分析

基于遺傳相似系數，利用UPGMA法對16份材料進行聚類分析。在遺傳相似系數0.338處，16份供試材料被分為3類。

Ⅰ類僅‘清香白一個品種。它與其他品種親緣關系較遠。形態上花為皇冠型白色，株型高，中型圓葉。

Ⅱ類包括13個品種在遺傳相似系數0.364處又分2個亞類：第1亞類包括‘映紅和‘朱砂壘。株型均中高，圓葉，花色紅色和淺紅色，均屬紅色系。第2亞類包括11個品種，在遺傳相似系數0.376處又能分成2組。第1組包括‘藏枝紅和‘富貴滿堂2個品種。第2組包括‘黑海撒金、‘玉板白、‘富貴紅‘等9個株型中、矮品種。

Ⅲ類包括‘三變賽玉和‘鳳丹白2個品種。形態上株型均高、直立，長葉，花色為粉白色和白色均屬白色系。但兩者花型不同，為托桂型和單瓣型。聚類分析圖如圖2所示。

2.3不同雜交組合與結實率的關系

由表2可知，父本相同的情況下，單瓣型牡丹（如‘鳳丹白、‘黑海撒金）的結實數較高，育性好，可獲得更多的雜交種子，應多選其做母本；重瓣型牡丹（如‘雪塔）由于雌蕊瓣化嚴重，育性較差，作母本結實數會低甚至不結實，因此不宜作母本，但其花粉可作父本進行雜交。

根據表2各雜交組合結實數可知，如同是‘清香白作母本，授粉的花朵數相同的情況下，父本是‘雪塔得雜交種子數為23粒，父本是‘富貴滿堂得雜交種子數為57粒，父本是‘藏枝紅得雜交種子數為15粒。相同母本的不同雜交組合的結實數存在差異，表明父本可能是影響結實數不同的主要因素，結實數因父本品種不同而有所區別。

2.4親緣關系與結實率的關系

表2中列出了各組合的結實數以及親本間的相似系數，可見結實數與其相似系數間有著一定的相關。♀‘朱砂壘ב藏枝紅♂相似性系數最低為0.3108，但是結實數最高為65粒。♀‘清香白ב富貴滿堂♂相似性系數為0.3245，結實數為57粒。相反，♀‘朱砂壘ב雪塔♂相似性系數為0.3958，結實數為11粒。♀‘雪塔ב富貴紅♂相似性系數為0.3883，結實率為12粒。所以相似系數較低時，親緣關系較遠，組合的結實數相應較高；相似系數在平均水平時，低于0.35的時候結實數相對較多。而高于0.35時一般呈下降趨勢，結實數一般；相似系數更大時，結實率相對較低。但是，當‘彩繪作母本時，結實數受親緣關系的影響不是很大，可能與其本身育性有關。

3討論

牡丹栽培品種間雜交基本不存在雜交不親和的現象，屬于近緣雜交[14]。前人的研究和本試驗結果都顯示，正確的親本品種選擇是提高牡丹親和性的有效途徑[15]。而且親本之間的親和性和母本育性共同作用影響了結實數。但是常規的雜交試驗分析不能得到具體的親緣關系數據來說明其對親和性的影響的不同。筆者得到父母本相似系數在小于0.35時，親和性增強。從一定程度上反映了牡丹雜交親緣關系對親和性影響的規律。

4結論

4.1牡丹雜交育種親和性的影響因素

對于親和性的影響，一般母本的影響大于父本。所以母本最好要選單瓣型結實力強，具有符合育種目標性狀的品種。根據父本相同，母本不同的雜交組合結實數的分析結果，其結實數的不同可能受母本本身育性的影響。根據母本相同，父本不同的雜交組合結實數的分析結果，父母本間的親和性應該為影響結種數主要因素。因此，親本之間的親和性和母本育性共同作用影響了結實數。而通過SRAP分析結果可知，雜交親本間的相似系數在0.31~0.35時結實數較高。所以較遠的親緣關系能增強牡丹父母本間親和性，提高結實率。而且發現‘彩繪為一種優良母本，雜交結實數高。

4.2基于親和性分析的親本選擇

雜交育種的第一步是性狀搭配，但是親本的親緣關系也是必須要考慮的[16]。在牡丹雜交育種中，其親本選擇的層次也是如此，首先考慮牡丹雜交育種的一般特性，其次要考慮選中親本的親緣關系遠近。

通過雜交試驗，發現牡丹栽培品種間雜交是比較容易成功的。所以，在實際工作中，可以首先考慮性狀的搭配，如花色、株型、葉形、生長勢等。但在為了提高親本間的親和性從而得到更多的雜交種子，選中的親本親緣關系盡量不能過近。由此，可以確定牡丹雜交育種中的親本選擇策略，在考慮到性狀搭配的情況下，多以單瓣型牡丹為母本，選擇親緣關系遠的品種先雜交。符合性狀組合、親緣關系又不太近的品種也可以選擇。

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