槲皮素降低TGF-β1誘導(dǎo)的風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞I型膠原蛋白生成

王 健，吉健華，全 瑛，王醫(yī)林，趙花妮

(西安市第五醫(yī)院風(fēng)濕科，陜西西安710000)

風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞生成的膠原蛋白與心肌纖維化關(guān)系緊密，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)又在風(fēng)濕性心臟病纖維化過程中發(fā)揮著重要作用［1］。槲皮素是一種具有多種生物學(xué)功能的多羥基黃酮類化合物，但是槲皮素對(duì)風(fēng)濕性心臟病的作用不明。體外培養(yǎng)的風(fēng)濕性心肌細(xì)胞，觀察槲皮素對(duì)風(fēng)心病是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料:西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供左室乳頭肌(瓣膜置換術(shù)的風(fēng)濕性心臟病患者，研究獲得西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)書及受試者簽署知情同意書);TGF-β1(Roche applied science);槲皮素來自北京化工廠產(chǎn)品。

1.2 方法:1)風(fēng)心病患者心肌細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)，左室乳頭肌行細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)。加入TGF-β1:0、2.5、5和10μg/L，孵育48 h，觀察膠原蛋白合成變化。5μg/L TGF-β1干預(yù)基礎(chǔ)上，加入 0、25、50和 100μmol/L槲皮素，觀察其對(duì)TGF-β1促膠原蛋白生成影響。2)RT-PCR檢測(cè)前膠原基因表達(dá):提取細(xì)胞總 RNA，測(cè)定濃度。將0.5μg RNA合成cDNA，以GAPDH為參照基因來擴(kuò)增Ⅰ型前膠原基因。PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件為:95℃條件下變性2 min，于94 ℃，30 s，60℃，1 min，68℃，2 min條件來擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后于68℃條件下延伸7 min。10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，經(jīng)EB染色，以目的基因/內(nèi)對(duì)照基因吸光度比值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示檢測(cè)目的基因表達(dá)。3)Western蛋白印跡30μg總蛋白行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗4℃孵育過夜，二抗孵育1 h。條帶用薄層掃描儀掃描，軟件分析各條帶吸光度值，計(jì)算1型膠原蛋白相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1促進(jìn)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞膠原蛋白合成

表1 TGF-β1促進(jìn)風(fēng)濕……