Sulfiredoxin-1通過調節peroxiredoxins表達提高大鼠星形膠質細胞抗氧化作用

周 楊，周云川，巫靜嫻，喻姍姍，趙 涌

(重慶醫科大學基礎醫學院病理學教研室分子醫學與腫瘤研究中心，重慶400016)

Sulfiredoxin-1(Srxn1)是內源性的小分子抗氧化蛋白，Srxn1 在組織細胞中具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性反應等保護作用，但具體的機制仍不清楚。在低水平H2O2刺激下，缺少Srxn1 功能的細胞，會導致其氧化還原平衡失調及凋亡［1］。吸煙人群易患COPD，同時患者肺組織內Srxn1 的表達極低，可能與吸煙打破患者肺內氧化/抗氧化平衡系統有關［2］。Peroxiredoxins(Prdxs)屬于新的抗氧化蛋白超家族，它包含PrdxⅠ～PrdxⅣ，其中PrdxI ～Ⅳ是最主要抗氧化亞型。其在機體的抗氧化防御系統中有著至關重要的作用［3］。Srxn1 作為抗氧化因子能通過催化過氧化的Prdxs，使其重新恢復抗氧化功能。本研究旨在探討星形膠質細胞氧化應激損傷過程中Srxn1 對Prdxs 活性的調控作用，為腦組織缺血后過氧化應激損傷保護提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

新生SD 大鼠［重慶醫科大學、SPF 級、動物合格證號SCXY(渝)20020003］、Srxn1 干擾慢病毒載體與陰性載體(上海吉瑪制藥技術有限公司)、DMEM/F12 和FBS(Gibco 公司)、H2O2(Sigma 公司)、LDH 和SOD(南京建成公司)、RNAiso Plus、RT-PCR 試劑盒、SYBR? Premix Ex Taq? (TaKaRa公司)、兔抗-GFAP 多克隆抗體(Santa Cruz 公司)、兔抗-Srxn1 多克隆抗體(北京博奧森公司)、兔抗-PrdxI-Ⅳ和兔抗Prdx-SO2/3H(Abcam 公司)。

1.2 星形膠質細胞的原代培養及純度鑒定

提取大腦皮質細胞，進行星形膠質細胞原代培養。GFAP 免疫組化染色鑒定星形膠質細胞純化率。0.01 mol/L PBS 快速漂洗待鑒定細胞，并用4%多聚甲醛固定30 min。用0.01 mol/L PBS 再次漂洗，5 min × 3 次。滴加適量封閉血清，濕盒，37 ℃，30 min，勿洗，滴加一抗GFAP(1∶50)，4 ℃濕盒過夜。0.01 mol/L PBS 漂洗，5 min ×3 次，滴加熒光二抗Alexa Fluor 594 (1∶100)，濕盒，37 ℃，30 min，PBS 清洗，避光加入Hoechst 33342 工作液標記所有細胞核，室溫作用20 min，PBS 清洗，甘油封片，熒光顯微鏡下發光。……