小鼠CSE基因啟動(dòng)子克隆及其活性測(cè)定

王茂先

(韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，廣東潮州521041)

基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制是后基因組時(shí)代一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。基因啟動(dòng)子是各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的區(qū)域，不同的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起著不同的作用，基因的表達(dá)是這些轉(zhuǎn)錄因子共同作用的結(jié)果［1-2］。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種具有臭雞蛋味道的有毒氣體，也是繼一氧化碳(NO)和一氧化氮(CO)之后的第3 種氣體信號(hào)分子［3-5］。硫化氫是新近發(fā)現(xiàn)的繼NO 和CO 后的第3 個(gè)內(nèi)源性氣體信使，有多生物學(xué)功能，如它參與低氧性肺動(dòng)脈高壓、感染性休克、急性肺損傷等多種疾病的病理生理過(guò)程［6-10］。胱硫醚γ-裂解酶(cytathiohine γ-lyase，CSE)是人類(lèi)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞利用半胱氨酸或者同型半胱氨酸生成H2S 的3 種酶之一，另外兩種酶是胱硫醚β-合成酶(cytathiohine β-synthase，CBS)和3-硫基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST)［11-14］。許多研究表明，H2S/CSE 可能涉及大量諸如心肌缺血、動(dòng)脈硬化、高血壓等心血管疾病的病理生理過(guò)程［15］。因此，研究胱硫醚γ-裂解酶基因啟動(dòng)子與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系具有重要的意義，不但可以闡明相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制，而且有可能找到相關(guān)疾病治療的藥物新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

血液基因組DNA 小量抽提試劑盒(Axygen 公司)。DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和質(zhì)粒中量提取試劑盒I(Biomiga 公司)。Trans5α感受態(tài)細(xì)胞、1 kb DNA Ladder Marker、Trans 2 kb DNA Marker、Trans 2 kb Plus II DNA Marker、Trans 8 kb DNA Marker 等DNA Marker (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。LA Taq、dNTP mix、XhoⅠ和KpnⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、堿性磷酸酶(BAP，含該酶的相關(guān)buffer)、T4 DNA Ligase 等試劑(TaKaRa 公司)。pGL4.12 質(zhì)粒、Dual-Luciferase? Reporter Assay System 試劑盒(Promega 公司)。Xfect? 轉(zhuǎn)染試劑盒(Clontech 公司)。DEME(高糖，不含丙酮酸鈉)、RPMI-1640、DMEM/F12 1∶1 培養(yǎng)基、1 ×DPBS(不含鈣、鎂、酚紅)、1 ×0.25%胰蛋白酶/EDTA、南美胎……