EMT與非EMT細(xì)胞在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

王雅娟，胡 潔，趙海燕，韓慧霞

(南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，廣東廣州510515)

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與非EMT 細(xì)胞是共同完成自發(fā)轉(zhuǎn)移的過(guò)程，由EMT 細(xì)胞負(fù)責(zé)降解細(xì)胞周圍的基質(zhì)，為非EMT 細(xì)胞鋪平了侵襲轉(zhuǎn)移的道路［1］。此觀點(diǎn)與以往認(rèn)為的發(fā)生EMT 的腫瘤細(xì)胞，其侵襲性比非EMT細(xì)胞強(qiáng)有不同之處。那么在大腸癌中發(fā)生EMT 的細(xì)胞與非EMT 細(xì)胞之間是否也存在這樣的協(xié)同合作關(guān)系呢?本實(shí)驗(yàn)使用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)長(zhǎng)期誘導(dǎo)大腸癌HT29 細(xì)胞使之發(fā)生EMT，將EMT與非EMT 的細(xì)胞混合培養(yǎng)，探討兩者在轉(zhuǎn)移過(guò)程中是否存在協(xié)同關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TGF-β1(Peprotec 公司);RPMI1640 培養(yǎng)基(萊德爾生物公司);新生牛血清(吉泰公司);Trizol 試劑(南京凱基公司);反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription System)試劑盒和熒光定量(SYBR Premix ExTaqTM)試劑盒(TaKaRa 公司);E-鈣黏素(Ecadherin)、波形蛋白(Vimentin)和GAPDH 引物(上海英駿公司合成)。綠色熒光蛋白質(zhì)粒(GFP)和紅色熒光蛋白質(zhì)粒(RFP)(Santa Cruz 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人大腸癌細(xì)胞系HT29 為本室冷凍保存;采用含20%新生牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用10－5g/L濃度的TGF-β1 連續(xù)刺激HT29 細(xì)胞［2-3］。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè):10－5g/L TGF-β1 連續(xù)刺激10 d后HT29 中Ecadherin 和Vimentin 的表達(dá)

1)RNA 的提取:參照說(shuō)明書，用Trizol 試劑常規(guī)提取細(xì)胞總RNA。

2)cDNA 第1 鏈的合成:按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)總體系為20 μL，其中樣品總RNA 2 μL，5 × PrimeScript 4 μL，Prime-ScriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，Random 6 mers 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC 水11 μL。37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃滅活5 s。

3)Real-time PCR:看家基因GAPDH 為內(nèi)對(duì)照。通過(guò)相對(duì)熒光定量PCR 方法，同時(shí)對(duì)Ecadherin、Vimentin和GAPDH 進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出不同樣本的Ecadherin、Vimentin 的相對(duì)表達(dá)量(表1)。

表1 Ecadherin、Vimentin和GAPDH 基因引物序列Table 1 Primer sequence of Ecadherin，Vimentin and GAPDH length(bp)

應(yīng)用Mx7500P 定量PCR 儀進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為95 ℃5 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，40 個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)。以Folds =2－ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)比關(guān)系，公式如下2－ΔΔCt=［Ct(target gene)－Ct(GAPDH)］實(shí)驗(yàn)組－［Ct(target gene)－Ct(GAPDH)］對(duì)照組［4］。……