兩種不同緩沖系統的多聚甲醛對鼠腦組化結果的影響

杜志榮，張 琳，陰 彬，彭小忠

（中國醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100005）

哺乳動物大腦皮質的發育長期以來都是發育生物學研究的焦點和熱點。目前用于研究大腦發育的組織化學技術主要有原位雜交技術和免疫熒光染色，而這些技術均需要前期的標本制備，尤其是取材后的組織固定。組織固定的主要目的是盡可能保持組織內待檢測物的原位性、完整性和免疫活性［1］，所以組織固定的效果往往決定著組化實驗最終結果的成敗。4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）因其優良的理化性質成為目前固定標本組織的常用固定劑之一［2－3］，而關于其配制方法，尤其是用于溶解它的溶劑的選擇目前還未有定論。本研究以此問題為出發點，比較不同溶劑的4%PFA對鼠腦組織的固定效果，探討最佳的組織固定方法。

1 材料與方法

1.1 材料:1）實驗動物:SPF級懷孕的CD1小鼠，雌性，取材時的孕期分別為 10.5 d（E10.5）、E11.5、E12.5、E16.5d（北京大學醫學部實驗動物處）。2）化學試劑:0.1 mol/L PB緩沖液（pH 7.4）:81 mmol/L Na2HPO4，19 mmol/L NaH2PO4;0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）:NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L（上海生工公司）;PFA（Sigma公司）;Pax6抗體和Ctip2抗體（Abcam公司）;地高辛抗體（Roche公司）。3）RNA探針:所需cDNA均從小鼠大腦中獲得，連接于pGEM-3zf載體，利用單酶切線性化質粒，體外轉錄后再乙醇沉淀回收RNA探針。

1.2 切片制備:1）標本采集:CD1孕鼠斷頸處死，剖腹，將胚胎取出后放入預冷的0.9%氯化鈉注射液中，E12.5及更早的胚胎整胚固定，E16.5鼠胚取腦，浸入4%PFA（0.01 mol/L PBS或0.1 mol/L PB）固定過夜。第2天用25%蔗糖溶液（0.01 mol/L PBS或0.1 mol/L PB）脫水，24 h后包埋，于－80℃冰箱中冷凝備用。2）切片:以16 μm厚度切片。

1.3 原位雜交:組織切片于4%PFA 20 min，PK緩沖液（2 μg/mL蛋白酶 K）常溫 10 min，再 DEPC-4%PFA 10 min，0.1 mol/L三乙醇胺（不含RNA酶）常溫攪拌10 min，?！?br>