miR-196b慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和功能鑒定

劉 玥，帥 春，尹 虹，宋艷斌*，馬文麗*

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東廣州510515;2.廣東省婦幼保健院新生兒科越秀院區(qū)，廣東廣州 510000）

miRNA可通過(guò)與靶mRNA特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA降解或者抑制翻譯，進(jìn)而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控［1］。miR-196b位于7號(hào)染色體短臂（7p15.2），其高表達(dá)和許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如口腔癌［2］、胃癌［3］和鼻咽癌［4］等，也可作為胰腺上皮內(nèi)瘤變的診斷標(biāo)志物［5］，并可判斷成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤患者的預(yù)后［6］。miR-196b和白血病的關(guān)系也很密切，其在混合系白血?。∕ixed Lineage Leukemia，MLL）［7］、B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL）［8］患者中低表達(dá)，在 T 細(xì)胞 ALL 患者［9］、兒童ALL患者中［10］高表達(dá)。miR-196b可調(diào)節(jié)造血功能，并隨時(shí)間推移表達(dá)逐漸下降［11］。miR-196b在慢性粒細(xì)胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia，CML）中的研究很少，因此本研究通過(guò)構(gòu)建miR-196過(guò)表達(dá)載體，并在K562細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，為研究其對(duì)慢粒發(fā)生發(fā)展的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓樣本（南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院提供），與受試者簽署知情同意書并獲得南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)書;質(zhì)粒 plVTHM、psPAX2、pMD2.G（南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院張寶副教授惠贈(zèng)）;K562細(xì)胞（廣東省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）;293T細(xì)胞（南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供）;大腸桿菌 DH5α（Escherichia coli，E.coli）由本室保存。

Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（GE公司）;QIAamp?DNA Mini and Blood Mini Kit和QIAGEN Plasmid Midi Kit（Qiagen公司）;EX Taq DNA聚合酶和SYBR Premix Ex TaqⅡ（大連寶生物工程公司）;限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA連接酶（New England Biolabs公司）;Wizard? SV瓊脂糖膠和PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)（Promega公司）;胎牛血清（Gibco公司）;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）;Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit（上海吉瑪公司）;引物合成及測(cè)序由Invitrogen（廣州）公司完成;Cell Counting Kit（CCK-8）（DOJINDO公司）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建慢病毒表達(dá)載……