沉默FOXC2 對TGF-β1 誘導的MCF-7 細胞上皮－間質轉化的逆轉作用

屈洪波， 吳誠義△， 范原銘， 韓明利， 陳 鑫， 湯為學

(1重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌外科，2 重慶市神經病學重點實驗室，重慶400016)

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)指的是上皮細胞失去其上皮樣表型，獲得間質樣表型的過程，其相反過程稱之為間質-上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition，MET)，兩者不僅在胚胎發育、損傷修復及組織歸巢中發揮重要作用，也在腫瘤侵襲及轉移中起著關鍵性作用［1-3］。2007 年，Mani 等［4］發現叉頭框C2(forkhead box C2，FOXC2)通過調控EMT 參與乳腺癌侵襲轉移，可能是基底樣乳腺癌預后判斷的一種重要分子標志物。類似的，Zagouri 等［5］發現MET 現象在三陰乳腺癌中頻繁出現可能是其不良預后的表現。最近，Yu 等［6］研究證實循環腫瘤細胞通過在EMT 和MET 中動態表達轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)信號分子和FOXC1 轉錄因子，從而逃避化療的殺傷作用。目前，有關轉錄因子FOXC2 在乳腺癌EMT 中的作用及機制的研究尚未見報道。因此，我們擬建立TGF-β1誘導的乳腺癌MCF-7 細胞EMT模型和FOXC2 基因RNA 干擾慢病毒表達載體，探討沉默FOXC2 表達對TGF-β1誘導的MCF-7 細胞上皮間質轉化的逆轉作用及對乳腺癌侵襲性的影響，為針對于乳腺癌的靶向治療提供新的線索。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細胞系MCF-7 購自中國科學院上海細胞庫，慢病毒包裝質粒:pGCL-GFP-LV、pHelper1.0 及pHelper2.0 購自上海吉凱基因公司;大腸桿菌DH5α由重慶市神經病學實驗室保存;限制性內切酶Age I和EcoR I、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及T4 連接酶(NEB);質粒DNA 提取試劑盒(Qiagen)，Lipofectamine 2000(Invitrogen);人重組TGF-β1(Pepro-Tech);單克隆山羊抗人FOXC2 和單克隆鼠抗人上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、緊密連接蛋白1(claudin-1，CLDN1)、纖維連接蛋白1(fibronectin-1，FN1)及β-actin 抗體(Santa Cruz);FITC 標記兔抗鼠II 抗和TRITC 標記的兔抗鼠II 抗(北京中杉金橋生物技術有限公司);總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、DAPI 染色液及HRP 標記的兔抗鼠II 抗和兔抗山羊II 抗(碧云天生物技術研究所);總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、Taq DNA 聚合酶及DNA marker(大連寶生物工程有限公司);PCR 引物設計及合成(上海生工生物工程公司);Transwell 小室(Millipore)，胎牛血清及DMEM 高糖培養基(Gibco)。

2 方法

2.1 細胞培養和MCF-7 細胞EMT 模型的建立 乳腺癌MCF-7 細胞在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養，用含有10% 胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 慶大霉素及5 U/L 胰島素的DMEM 高糖培養基培養。用0.25% 胰酶消化傳代，待細胞生長至板底70% ～80%后，換成無血清培養基饑餓過夜，再加入含有5 μg/L TGF-β1的高糖DMEM 培養基誘導MCF-7 細胞EMT 發生，期間適時加入含有TGFβ1的完全培養基維持間質狀態，倒置相差顯微鏡下觀察不同時間下的細胞形態。

2.2 免疫熒光染色檢測MCF-7 細胞上皮和間質相關標志物表達 將MCF-7 細胞以1 ×108/L 密度接種于24 孔板中預置的蓋玻片上，待細胞貼壁后換成無血清培養基饑餓過夜，加入5 μg/L TGF-β1的高糖DMEM 培養基誘導MCF-7 細胞EMT 發生，96 h 后取出蓋玻片，0.4%多聚甲醛固定20 min，如果抗原為核表達需用0.5% Triton X-100 透膜15 min;用5%BSA 封閉30 min，加入單克隆鼠抗人E-cad、CLDN1和FN1 的I 抗(濃度均為1∶50)，4 ℃孵育過夜，加FITC 或TRITC 標記的兔抗鼠Ⅱ抗(濃度均為1∶50)，37 ℃下避光孵育1.5 h，PBS 沖洗3 次后加DAPI 染色液，室溫作用15 min，緩沖甘油封固，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 人FOXC2 基因RNA 干擾慢病毒載體的構建及鑒定 選擇GenBank 中人FOXC2 基因編碼區序列(NM_005251.2)作為分析序列。設計及合成FOXC2基因的siRNA 寡核苷酸序列和發卡樣結構的雙鏈OligoDNA。構建各個干擾序列的表達質粒，轉染至293T 細胞，根據FOXC2 抑制率，確定最終有效靶序列為5'-CTACCTGAGCGAGCAGAAT-3'，由上海吉凱基因公司合成。其siRNA 的DNA Oligo:5'-CCG GCTACCTGAGCGAGCAGAATCTCGAGATTCTGCTCGCTCAGGTAGTTTTTG-3'。陰性對照的核心序列為5'-TT CTCCGAACGTGTCACGT-3'，其DNA Oligo:5'-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTACGTGACACGTTCGGAGA-ATTTTTG-3'。寡核苷酸經退火形成雙鏈DNA。經T4 連接酶與Age I 和EcoR I 雙酶切后的pGCL-GFP載體連接，形成表達siRNA 的重組慢病毒質粒載體(pGCL-GFP-FOXC2-siRNA)，經酶切鑒定。轉化DH5α 大腸桿菌，搖菌后接種到含氨芐青霉素的LB瓊脂培養基上，37 ℃培養16 h，挑取重組陽性克隆行PCR 篩選。

2.4 慢病毒包裝及滴度測定 以Qiagen 公司的質粒抽提試劑盒對慢病毒包裝系統中3 種質粒:表達最有效靶序列siRNA 的重組慢病毒質粒載體pGCGFP-LV、pHelper1.0 及pHelper2.0，分別進行高純度無內毒素DNA 抽提，質粒DNA 溶于除菌的TE 中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質粒DNA 的A260/A280在1.8 ～2.0 之間。按說明共轉染293T 細胞，8 h 后更換為完全培養基，48 h 后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，對濃縮后得到高滴度的慢病毒液，以293T 細胞GFP 蛋白的表達水平經孔稀釋法測定病毒滴度。

2.5 乳腺癌MCF-7 細胞培養及轉染 將TGF-β1誘導成功后的間質化的MCF-7 細胞分為3 組:未轉染組、control-siRNA 組及FOXC2 -siRNA 組。在6 孔培養板每孔中接種2 ×105個細胞，待其生長至底板30% ～50%時，按感染復數(MOI =20)加入慢病毒顆粒進行轉染實驗，以空載體病毒液作為對照，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況。2 周后采用流式分選出GFP 陽性表達的細胞，通過RTPCR 和Western blotting 檢測FOXC2 mRNA 及蛋白表達情況。

2.6 RT-PCR 檢測MCF-7 細胞中E-cad、CLDN1 及FN1 mRNA 表達 將TGF-β1誘導的間質化MCF-7細胞經轉染，并分選出GFP+細胞擴大培養，待長至瓶底80%后，加入Trizol 試劑常規抽提總RNA，逆轉錄得到cDNA。以β-actin 為內參照，檢測目的基因表達變化，β-actin 上游引物5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3';FOXC2 上游引物5'-CTCAACGAGTGCTTCGTCAA-3'，下游引物5'-GCTCCTCCTTCTCCTTGGAC-3';E-cad 上游引物 5'-TTGCTACTGGAACAGGGACAC-3'，下游引物5'CCCGTGTGTTAGTT CTGCTGT-3';CLDN1 上游引物5'-AGAAGATGAGGATGGCTGTCA-3'，下游引物5'-TTGGTGTTGGGTAAGAG GTTG-3';FN1 上游引物5'-G CCTTCAAGTTCCTGTTAC-3'，下游引物5'-GACTCTCTCCGCTTGG ATTCT-3'。設置反應參數:95 ℃預變性15 s，95 ℃10 s，58℃30 s，72 ℃1 min，共進行35 個循環。RT-PCR 產物條帶采用Quantity One 軟件分析，以β-actin 為內參照，以目的基因灰度值/β-actin 灰度值計算mRNA相對表達量，以上實驗重復3 次，取平均值。

2. 7 Western blotting 檢測MCF-7 細胞中E-cad、CLDN1 及FN1 蛋白表達 將TGF-β1誘導的間質化MCF-7 細胞經轉染、分選出GFP+細胞擴大培養，收集細胞后，加入RIPA 裂解液及PMSF，冰上靜置30 min。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，將上清移至一新的EP 管中，BCA 法測定蛋白濃度，沸水煮5 min后上樣，采用8%SDS-PAGE 電泳，先用40 V 電泳30 min 左右至跑到分離膠處，再改為80 V 電泳1.5 h左右，直至溴酚藍跑至底部。做好“三明治”夾板，250 mA 恒流轉膜1.5 h，20 mL 封閉液37 ℃孵育2 h，加入單克隆鼠抗人E-cad、CLDN1 和FN1 的Ⅰ抗(濃度均為1∶200)，4℃孵育過夜，次日TBST 洗膜3次，HRP 標記的兔抗鼠Ⅱ抗(濃度均為1∶1 000)，37℃孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次。ECL 化學發光試劑孵育1 min，置于暗盒內曝光拍照，曝光時間30 s。以β-actin 為內參照，以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值計算目的蛋白相對表達量。以上實驗重復3 次，取平均值。

2.8 Transwell 小室檢測MCF-7 細胞的侵襲能力

將MCF-7 細胞分為3 組:空白對照組、TGF-β1誘導組和FOXC2-siRNA 組，每組設3 個復孔。各組細胞用0.25%胰酶消化后，用含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養基重懸為1 ×108/L。每個Transwell 上室加入0.3mL 這種細胞懸液(約3 ×104細胞)，下室加入0.6 mL 含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養基，37 ℃、5%CO2孵箱中培養24 h 后，取出小室并棄去上室液體，用棉簽擦去膜上層細胞，4%多聚甲醛液固定15 min，瑞氏染色液染色20 min，于倒置相差顯微鏡下計數膜下層的細胞。200 倍光鏡隨機選擇10 個視野計數，計算平均值。

3 統計學處理

應用SPSS 19.0 統計分析軟件，數據以均數±標準差(mean ±SD)表示，組間均數比較應用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 TGF-β1 誘導MCF-7 細胞形態學變化觀察

MCF-7 細胞經5 μg/L TGF-β1誘導的第3 天，細胞形態發生明顯變化，倒置相差顯微鏡觀察顯示，第0 d 未處理的MCF-7 細胞呈現典型上皮細胞形態，細胞排列緊密;而經TGF-β1處理后，大部分細胞喪失了多角形上皮表型，細胞明顯拉長，細胞間連接更疏松，取而代之的為一種梭形、纖維細胞樣及間質細胞樣形態，見圖1。

Figure 1. The morphology of MCF-7 cells induced by TGF-β1(×100).A:the cells showed multi-angle shape or epithelial phenotype characteristics in control group (0 d);B，C:the cells showed spindle-shaped changes in TGF-β1 group (3 d and 6 d，respectively).圖1 TGF-β1 誘導MCF-7 細胞發生EMT 時的細胞形態學變化

2 TGF-β1 誘導MCF-7 細胞EMT 后上皮和間質相關標志物的表達

經5 μg/L TGF-β1處理MCF-7 細胞96 h 后，免疫熒光染色顯示，相比于對照組，上皮性標志物Ecad 和CLDN1 在細胞膜表達明顯減少，而間質性標志物FN1 表達明顯增加，見圖2。

Figure 2. The expression of the markers related to EMT in MCF-7 cells induced by TGF-β1(×200).Yellow arrows indicate positive expression.圖2 TGF-β1 誘導MCF-7 細胞EMT 后EMT 相關標志物的表達

3 重組慢病毒載體滴度的測定及MCF-7 細胞轉染

采用逐孔稀釋法，轉染96 h 后，熒光顯微鏡可見不同稀釋倍數下熒光細胞所占比例，根據不同病毒顆粒數計算出病毒滴度為7 ×1014Tu/L，說明有大量質粒進入感染細胞，病毒包裝成功。使用上述2 組病毒顆粒感染MCF-7 細胞，12 h 后觀察未見細胞明顯死亡，說明FOXC2-siRNA 慢病毒本身對細胞無明顯毒害作用，實驗組與對照組之間無明顯差異。轉染12 h 后，更換為完全培養基，48 h 后觀察有熒光蛋白表達，且表達量在96 h 達到最大，感染效率＞80%，并在之后保持在高表達狀態，沒有明顯下降，可用于后續實驗，見圖3。

Figure 3. The green fluorescent protein expression in MCF-7 cells transfected FOXC2-siRNA lentiviral vector observed by fluorescent microscope (×200).A:inverted phase-contrast microscope;B:fluorescent microscope;C:merged.圖3 FOXC2-siRNA 慢病毒轉染MCF-7 細胞的綠色熒光蛋白表達

4 沉默FOXC2 表達對TGF-β1 誘導的MCF-7 細胞EMT 相關標志物mRNA 表達的影響

RT-PCR 凝膠電泳條帶顯示，FOXC2-siRNA 組、control-siRNA 組及未轉染組FOXC2 mRNA 表達量分別為0.08 ±0.01、0.44 ±0.06 和0.59 ±0.08;E-cad mRNA 表達量分別為0.67 ± 0.11、0.41 ± 0.08 和0.53 ±0.09;CLDN1 mRNA 表達量分別為:0.56 ±0.07、0.23 ±0.04 和0.21 ±0.03;FN1 mRNA 表達量分別為0.07 ±0.01、0.64 ±0.08 和0.75 ±0.12。與control-siRNA 組及未轉染組比較，FOXC2-siRNA 組上皮性標志物E-cad 和CLDN1 明顯上調，而間質性標志物FN1 明顯下調，差異均有統計學意義(P ＜0.05)，見圖4。

5 沉默FOXC2 表達對TGF-β1誘導的MCF-7 細胞EMT 相關標志物蛋白表達的影響

Western blotting 凝膠成像條帶顯示，與未轉染組及control-siRNA 組比較，FOXC2-siRNA 組FOXC2 蛋白的表達明顯降低，FOXC2 下游E-cad 及CLDN1 表達上調，間質性標志物FN1 表達下調，3 組間差異有統計學意義(P ＜0.05)，見圖5。

Figure 4. The mRNA expression of FOXC2 (A)and the markers related to EMT (B:E-cad;C:CLDN1;D:FN1)in mesenchymal MCF-7 cells analyed by RT-PCR.M:marker;1:FOXC2-siRNA group;2:control-siRNA group;3:non-transfection group.圖4 RT-PCR 檢測間質化MCF-7 細胞中FOXC2 和EMT 相關標志物mRNA 的表達

Figure 5. The protein expression of FOXC2 and EMT-related markers in mesenchymal MCF-7 cells analyed by Western blotting.1:non-transfection group;2:control-siRNA group;3:FOXC2-siRNA group.Mean±SD. n=3. * P ＜0.05 vs non-transfection or control-siRNA.圖5 Western blotting 檢測間質化MCF-7 細胞中FOXC2 EMT 相關標志物蛋白的表達

6 沉默FOXC2 表達對TGF-β1 誘導的MCF-7 細胞侵襲能力的影響

對照組、TGF-β1組和FOXC2-siRNA 組穿過人工基質膠的間質化MCF-7 細胞的數目分別為16 ±3、52 ±6 及13 ±2，TGF-β1組侵襲細胞數明顯高于其它2 組，差異有統計學意義(P ＜0.05)，見圖6。

Figure 6. Impact of FOXC2 silencing on invasion of mesenchymal MCF-7cell was assayed using Transwell chambers(×200).A:control group;B:TGF-β1-induced group;C:FOXC2-siRNA group.圖6 沉默FOXC2 對間質化MCF-7 細胞體外侵襲能力的影響

討 論

EMT 在多種腫瘤演進中扮演重要角色，有些是瞬時事件，有些表現為永久性EMT 特征。EMT 使得上皮細胞失去細胞極性及與基底膜連接等上皮樣特征，而獲得高遷移、侵襲、抗凋亡及降解細胞外基質等間質樣特征［7］。EMT 發生受到諸多因素的影響，其中TGF-β1是誘發EMT 的關鍵始動因素，TGF-β1可通過Smad 或非Smad 信號通路誘導某些上皮細胞發生EMT［8-9］。

研究表明，一些重要的轉錄調控因子，如Twist、Snail1、Slug、FOXC2、ZEB1/2 等能夠誘導EMT 發生，它們共同特征是含有能識別靶基因啟動子上E-box基序的DNA 結合序列［10-11］。更多的EMT 相關標志物鑒定，為EMT 模型的建立提供理論依據。本研究發現，MCF-7 細胞在外源性TGF-β1誘導下，48 h 內顯示出細胞生長抑制現象，這與先前推論的TGF-β1在早期對細胞表現為生長抑制一致，從第3 d 開始至第6 d，細胞逐漸拉長，形成長梭形具有運動能力的成纖維樣細胞，說明EMT 轉錄因子表達量需要積累到一定濃度才能與E-cad 的啟動子結合抑制其表達，導致細胞間連接的松散，可能是因為從轉錄到翻譯，再到蛋白質合成并發揮作用需要一定的時間，說明MCF-7 細胞EMT 過程表現出時序特征［12-13］。而免疫熒光檢測結果也顯示上皮性標志物E-cad 及CLDN1 在TGF-β1誘導的MCF-7 細胞膜上表達降低，而FN1 在間質樣細胞中表達明顯增加。Gerhard等［14］在化生性乳腺癌研究中，發現claudins 蛋白及E-cad 蛋白表達缺失或降低與波形蛋白高表達及癌干細胞表型相關，表明化生性乳腺癌具有低緊密連接蛋白特征。其它研究也發現EMT 相關轉錄因子高表達與Claudin-low 及化生性乳腺癌表型相關［10］。類似的，Jung 等［15］發現claudin-1、claudin-2、claudin-3及claudin-4 的低表達與胃癌的侵襲性及不良預后相關。

FOXC2 屬于人類叉頭框(forkhead box，FOX)家族成員之一，FOX 蛋白不僅作為典型轉錄因子通過招募共激活因子等調節基因轉錄，有些還能直接同凝聚染色質結合參與重構，協同其它轉錄因子參與轉錄調節，PI3K/Akt、TGF-β/Smad 和MAPK 等多個信號通路都可以影響FOX 蛋白磷酸化水平，調節其活性。新近研究發現FOX 蛋白家族中的多個成員通過調控上皮細胞可塑性，在腫瘤惡性進展中發揮著促進或抑制作用［16］。如牟永告等［17］研究顯示核轉錄因子FOXP3 陽性的星形細胞瘤較FOXP3 陰性的星形細胞瘤的預后差，可能成為星形細胞瘤免疫調節的新靶點。而蔣光愉等［18］研究顯示FOXA1 及BRCA1 在三陰乳腺癌中表達呈負相關，提示FOXA1在乳腺癌中發揮著抑癌作用。目前，有關FOXC2 在乳腺癌侵襲轉移中作用及其是否參與TGF-β1調控的EMT 機制，仍不清楚。為此，我們構建FOXC2 基因RNA 干擾慢病毒表達載體，轉染至間質化MCF-7細胞中，RT-PCR 及Western blotting 結果均顯示間質性標志物FN1 表達下調，而上皮性標志物E-cad 及CLDN1 表達上調，提示EMT 過程發生逆轉，即FOXC2 可逆轉間質化MCF-7 細胞回復到上皮表型，這與EMT 機制可逆性，即MET 機制相符［19-20］。而Transwell 小室模型也證明沉默FOXC2 表達能夠顯著降低穿過人工基質基底膜間質化的MCF-7 細胞數量，且穿過基底膜的細胞形態學回復至上皮表型，不僅表明乳腺癌細胞侵襲能力受到抑制，同時也表明EMT 是一種動態及可逆的過程。以上結果表明FOXC2 可能作為TGF-β1下游靶基因參與MCF-7 細胞EMT 和MET 的調控。

綜上所述，外源性TGF-β1能夠誘導MCF-7 細胞發生EMT，沉默FOXC2 表達可逆轉EMT 發生并降低其侵襲轉移能力，提示FOXC2 在乳腺癌侵襲轉移中發揮重要作用;而FOXC2 作為轉錄因子，處于信號通路級聯反應的中心環節，對其上游信號轉導通路及下游轉錄調控的直接靶基因尚有待進一步研究。

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