纖溶酶原激活物抑制劑1 siRNA對大鼠肺纖維化的治療作用*

張彥萍， 田園園， 白林林， 王衛麗， 劉 建， 李文斌， 馬麗華

(1河北醫科大學第二醫院呼吸科，河北 石家莊050000;2河北醫科大學基礎醫學院病理生理教研室，河北 石家莊050017)

特發性肺纖維化以成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞及細胞外基質過度沉積為特征［1］。越來越多的研究表明，纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)可能作為獨立的危險因素參與了肺纖維化的進程［2］。RNA 干擾技術的應用為研究PAI-1 在肺纖維化發生中的作用提供了更加有利的手段。我們前期已經通過組織學觀察到氣管內滴入PAI-1 小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)可減輕肺組織內膠原沉積［3］。然而，其作用機制尚不完全清楚，本研究我們從分子水平進一步觀察PAI-1 siRNA 治療后對肺組織Ⅲ型膠原、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA 表達的影響，并初步探討其機制。

材 料 和 方 法

1 材料

Wistar 大鼠(河北省實驗動物中心)，博萊霉素(bleomycin，BLM;天津太河制藥有限公司)，PAI-1 siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)，PAI-1 活性測定試劑盒(Diagnostica)，RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)，Ⅲ型膠原、α-SMA、TIMP-1 和內參照GAPDH 的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列見表1。

表1 RT－PCR 引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-PCR

2 方法

2.1 博萊霉素肺纖維化模型的建立和PAI-1 siRNA的處理 Wistar 清潔級雄性大鼠72 只，體重(140 ±20)g，采用隨機數字表法將實驗動物分成4 組，對照組(control 組)、BLM 組、BLM + 非特異siRNA 組(BLM + N 組)和BLM + PAI-1 siRNA 組(BLM + P組)，每組18 只，無水乙醚局部麻醉，仰臥位固定，常規消毒，行頸正中切口，暴露氣管，BLM 組、BLM +N組和BLM + P 組按5 mg/kg 注入生理鹽水溶解的BLM 0.2 mL，control 組注入等體積生理鹽水。造模后，每周2 次氣管內給藥，4 周共給藥8 次，BLM +P組注入DEPC 水溶解的PAI-1 siRNA 7.5 nmol (0.2 mL);BLM+N 組注入相同劑量的非特異siRNA;control 組和BLM 組注入0.2 mL 生理鹽水。上述4 組動物分別于第7 d、14 d 和28 d 各處死6 只，左側肺行肺泡盥洗，右中葉組織儲存于-80 ℃液氮中，行RT-PCR 檢測。

2.2 肺泡灌洗液中PAI-1 活性的測定 采用發色底物法測定肺泡灌洗液中PAI-1 活性，操作按照試劑盒說明書進行。

2.3 RT-PCR 法測定肺組織3 型膠原、α-SMA 和

TIMP-1 mRNA 的表達 采用一步法提取RNA。取大鼠新鮮的肺組織50 ～100 mg 放入勻漿管中，迅速加入1 mL TRIquick，冰上快速充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清。經加入氯仿、異丙醇、乙醇洗滌沉淀后，紫外分光光度儀對RNA 進行定量分析，以A260與A280比值了解RNA 的純度。另取1 μL RNA 在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測RNA 是否完整。按照試劑盒說明書進行反轉錄反應。PCR反應條件:94 ℃30 s，60 ℃(Ⅲ型膠原和TIMP-1)或58 ℃(α-SMA)30 s，72 ℃30 s，與內參照GAPDH 同管擴增，共30 個循環。

3 統計學處理

計量資料數據用均數±標準差(mean ±SD)表示。采用SPSS 13.0 進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，比較組間差異，有顯著差異者用最小顯著差(LSD)法進行兩兩比較，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 每周2 次氣管內滴注PAI-1 siRNA 持續抑制肺泡灌洗液中PAI-1 的活性

應用博萊霉素制作肺纖維化模型后，control 組動物身體健壯，BLM 組及非特異siRNA 組動物萎靡不振，呼吸急促，消瘦明顯，PAI-1 siRNA 組動物輕度呼吸困難，略有消瘦，雖然反復行氣管切開，但切口愈合良好，組織粘連不明顯。在我們最近發表的論文中，通過組織學觀察也證實博萊霉素肺纖維化模型制作成功［3］。

造模成功后，我們觀察到模型組7 d、14 d 和28 d 肺泡灌洗液中PAI-1 活性升高，與control 組比較有明顯差異，并且存在時間依賴性。每周2 次氣管內注入PAI-1 siRNA 后，BLM +P 組灌洗液中PAI-1 活性明顯減低，與同一時點BLM 組有明顯差異(均P ＜0.05)，BLM 組與BLM +N 組比較差異無統計學意義，說明非特異性siRNA沒有治療效果，見圖1。

Figure 1. The activity of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)in bronchoalveolar lavage fluid on day 7，14，and 28 after intratracheal injection or PAI-1 siRNA in bleomycin(BLM)-induced rat lung tissues. Mean ±SD.n=6. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs BLM.圖1 氣管內滴入PAI-1 siRNA 7 d、14 d 和28 d 支氣管肺泡灌洗液中PAI-1 活性的變化

2 PAI-1 siRNA 抑制肺組織Ⅲ型膠原的合成和α-SMA 的表達

由圖2、3 可見，氣管內滴入博來霉素7 d、14 d和28 d 后，BLM 組動物肺組織Ⅲ型膠原及α-SMA 表達明顯升高，與control 組比較有明顯差異，BLM 組與BLM+N 組比較無統計學意義。每周2 次氣管內注入PAI-1 siRNA 后，3 個時點BLM +P 組動物肺組織Ⅲ型膠原及α-SMA 表達均明顯減少，與同一時點BLM 組比較有明顯差異(均P ＜0.05)。

3 PAI-1 siRNA 抑制肺組織TIMP-1 的表達

圖4 顯示，在7 d、14 d、28 d，博來霉素誘導模型組動物肺組織TIMP-1 表達增加，BLM +P 組動物肺組織TIMP-1 的表達較同一時點BLM 組比較明顯減低(均P ＜0.05)。

Figure 2. The expression of collagen type Ⅲon day 7 (A)，14 (B)and 28 (C)after intratracheal injection of PAI-1 siRNA in BLMinduced rat lung tissues. M:marker. Mean±SD. n=6. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs BLM.圖2 氣管內滴入PAI-1 siRNA 7 d、14 d 和28 d 對肺組織Ⅲ型膠原表達的影響

Figure 3. The expression of α-smooth muscle (α-SMA)actin on day 7 (A)，14 (B)and 28 (C)after intratracheal injection PAI-1 of siRNA in BLM-induced rat lung tissues. M:marker. Mean ± SD. n =6. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs BLM.圖3 氣管內滴入PAI-1 siRNA 7 d、14 d 和28 d 對肺組織α-SMA 表達的影響

討 論

雖然RNA 干擾(RNAi)在哺乳動物細胞中成功應用僅有10 余年，但已經成為基因功能研究及基因治療的全新手段［4］。由于核酸酶的影響，siRNA 在動物體內不穩定，因此，如何將siRNA 遞送到動物體內已經成為RNAi 面臨的主要問題。對SARS 病毒、支氣管哮喘等模型的研究表明，鼻腔或氣管局部給藥可以在肺部產生顯著的靶向基因沉默［5-7］，但是這些模型大多在3 ～5 d，對肺纖維化這樣需要至少28 d 的長時間模型，如何減少核酸酶的影響還少有研究。為了產生最大的沉默效果，我們首先進行了細胞水平的實驗，觀察到PAI-1 促進成纖維細胞增殖和膠原合成［8］，PAI-1 siRNA 對肺成纖維細胞的沉默效率在70%左右［9］，然后我們將siRNA 進行甲基化修飾，以增加siRNA 的穩定性，局麻下采用每周2 次氣管內滴入的方式，將藥物直接注入大鼠肺組織，4周內共給藥8 次。我們觀察到PAI-1 siRNA 組動物精神萎靡不明顯，輕度呼吸困難，切口愈合良好，局部黏連較輕，操作時易于分離。同時，我們觀察到模型組肺泡灌洗液中PAI-1 活性隨著時間延長持續增加，說明肺纖維化過程中纖溶活性持續受損。滴入siRNA 后，7 d、14 d 和28 d 灌洗液中PAI-1 的活性明顯減低，說明我們的方法可以成功沉默PAI-1 基因，減少肺組織PAI-1 的表達。

Figure 4. The expression of TIMP-1 on day 7 (A)，14 (B)and 28 (C)after intratracheal injection of PAI-1 siRNA in BLM-induced rat lung tissues. M:marker.Mean±SD. n=6. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs BLM.圖4 氣管內滴入PAI-1 siRNA 7 d、14 d 和28 d 對肺組織TIMP-1 表達的影響

成功地沉默了PAI-1 基因后，我們進一步觀察了PAI-1 siRNA 對博萊霉素誘導的纖維化肺組織膠原沉積及成纖維細胞轉化的影響。我們知道，α-SMA是肌成纖維細胞特有的標志，α-SMA 表達增加表明成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，從而合成更多的膠原纖維。研究表明，肺纖維化程度與α-SMA 的水平有關［10］。我們通過PCR的方法觀察到氣管內滴入博萊霉素后，肺組織Ⅲ型膠原及α-SMA表達明顯升高，誘導肺纖維化發生。每周2 次氣管內滴入PAI-1 siRNA 可以使纖維化的肺組織Ⅲ型膠原及α-SMA表達減少。我們最近通過組織學和免疫組化研究也觀察到氣管內滴入PAI-1 siRNA 減少纖維化肺組織膠原沉積［3］，在細胞水平，我們也觀察到PAI-1 對成纖維細胞的直接作用［10］。我們認為，降低PAI-1 的表達可以抑制成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，抑制膠原合成，從而抑制肺纖維化的發生、發展。PAI-1 可能作為肺纖維化治療的新靶點。

我們進一步探討了PAI-1 siRNA 抑制肺纖維化的機制。近年來研究表明，PAI-1 在細胞增殖、凋亡、腫瘤血管的發生、促進動脈硬化及器官纖維化中發揮重要作用［11-12］，已有嘗試應用PAI-1 siRNA 治療肝纖維化的報道［13］。但是機制還不清楚。我們知道，PAI-1 的生理作用是抑制尿激酶型纖溶酶原激活劑和組織型纖溶酶原激活劑，進而抑制纖溶酶的活性。纖溶酶能夠降解膠原纖維已是不爭的事實，更有近來Horowitz 等［14］和Bauman 等［15］認為纖溶酶活化可以促進成纖維細胞凋亡和前列腺素E2的合成。本研究中我們沒有從傳統觀念觀察PAI-1 對纖溶酶的影響，而是觀察PAI-1 siRNA 對肺組織膠原產生的直接作用和對TIMP-1 表達的影響。我們知道，基質金屬蛋白酶及其組織抑制物的平衡在肺纖維化的發生中起重要作用，過度表達TIMP-1 可以使細胞外基質合成過剩，沉積于肺間質，導致肺纖維化，我們在實驗中觀察到氣管內滴入PAI-1 siRNA 可以使纖維化的肺組織中TIMP-1 表達減少，同時伴隨有肺纖維化的減輕，因此我們認為，PAI-1 siRNA 可能是通過打破基質金屬蛋白酶及其組織抑制物的平衡發揮作用的。

總之，通過本實驗我們觀察到，每周2 次氣管內注入PAI-1 siRNA 可以使支氣管肺泡灌洗液PAI-1表達持續減低，并且抑制肺纖維化的發生、發展，在此過程中，伴隨有基質金屬蛋白酶及其組織抑制物的失衡。PAI-1 有望成為肺纖維化治療的新靶點。

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