ACE2 基因敲除小鼠止血帶休克后腎組織ACE/AngⅡ表達的變化及其與腎損傷的關系*

王建軍， 楊秀紅， 王銀環， 劉英超， 王小君， 張 田， 孫 娜， 張連元

(河北聯合大學基礎醫學院生理教研室，河北 唐山063000)

急性腎損傷是臨床上休克后常見的并發癥，其機制不詳。我們的前期研究發現，止血帶休克(tourniquet shock，TS)后小鼠腎組織血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)表達上調和ACE2 表達下調，同時TS 小鼠出現腎氧化應激反應增強、腎功能損傷變化［1］。ACE 可催化血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)生成AngⅡ，而ACE2 作為腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)的負調控分子可將AngⅡ降解為Ang(1-7)。據文獻報道，ACE2 能夠預防AngⅡ介導的腎氧化應激、炎癥和纖維化作用［2］。因此我們設想，ACE2 基因敲除(ACE2 KO)可能通過增加腎ACE/AngⅡ表達促進動物體內氧化應激機制而加重器官損傷。為此在本實驗中，我們應用ACE2 KO 小鼠制作TS 模型，觀察ACE2 KO 小鼠在TS 后腎組織ACE/AngⅡ表達變化以及腎損傷的反應，旨在進一步探討ACE2 在休克后急性腎損傷中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、Western blotting 蛋白marker、X 線片ECL 發光劑、定影劑和顯影劑均為碧云天試劑公司產品;ACE、ACE2 和β-actin 抗體均購自Abcam;AngⅡ酶聯免疫吸附測定ELISA 試劑盒購自武漢優爾生科技股份有限公司;丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，Cr)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物 6 月齡雄性野生型和ACE2 基因敲除C57BL/6 小鼠由中國醫學科學院實驗動物研究所引進，于河北聯合大學實驗動物中心飼養，自由進食、飲水。

2 方法

按照蛋白提取試劑盒說明進行操作。將一側腎組織100 mg 放入玻璃勻漿器，加入1 mL 蛋白裂解液勻漿，12 000 r/min 離心5 min，留取上清。用BCA 法測定蛋白濃度，用裂解液將各蛋白配成濃度為6 g/L，取10 μL 蛋白樣品與5 ×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min 后SDS-PAGE 電泳，轉硝酸纖維素膜3 ～5 h，5%BSA 室溫封閉1 h，I 抗孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，Ⅱ抗孵育0.5 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min。ECL 發光試劑均勻鋪于膜上孵育2 min，曝光后，顯影、定影。結果用ImageJ 圖像分析軟件進行分析。

2.4 ELISA 測定腎組織AngⅡ水平 將100 mg 腎組織放入玻璃勻漿器，加入5 mL PBS 研磨，12 000 r/min離心5 min，留取上清。應用競爭抑制酶聯免疫分析法測定樣本中AngⅡ水平。簡單地說，往已包被鼠AngⅡ單克隆抗體的微孔中同時加入生物素標記的抗原和待測樣品50 μL，37 ℃溫育1 h。洗滌3次，然后加入HRP 標記的親和素，37 ℃溫育30 min。洗滌5 次，加入90 μL 底物TMB 顯色15 min。加終止液終止反應。用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度，同時繪制標準曲線，計算樣品濃度。

2.5 SOD 活性和MDA 含量測定 取腎組織100 mg，用RIPA 裂解液制成10%組織勻漿，離心、提取上清。硫代巴比妥酸(TBA)法測組織MDA，結果以μmol/g 蛋白表示;氮藍四唑(NBT)法測組織SOD 活性，結果以103U/g 蛋白表示。按照試劑盒說明進行操作，用酶標儀分別在535 nm 和550 nm 波長下測定吸光度。

2.6 BUN 和血清Cr 的測定 待全血凝固后，3 000 r/min 離心5 min 取上清。二乙酰-肟比色法測定BUN 含量，結果以mmol/L 表示;苦味酸法測定血清Cr，結果以μmol/L 表示。按照試劑盒說明進行操作，用酶標儀分別在640 nm 和510 nm 波長下測定吸光度。

2.1 模型復制 采用我室常規復制小鼠TS 模型，水合氯醛按3 mL/kg 腹腔注射麻醉小鼠，用橡皮帶環繞結扎小鼠雙后肢根部，阻斷血流2 h 后松開橡皮帶使血流再灌注，于4 h 摘眼球放血處死小鼠，取血漿和腎組織，-70 ℃冰箱保存待各指標測定。

2.2 動物分組 將2 種小鼠分別隨機分為(1)野生型小鼠(WT)組，不進行結扎處理;(2)野生型止血帶休克(WT+TS)組，結扎止血帶;(3)ACE2 基因敲除(KO)組，不進行結扎處理;(4)ACE2 基因敲除止血帶休克(KO+TS)組，結扎止血帶。每組6 只動物。

2.3 Western blotting 測定腎組織ACE 蛋白表達

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean ±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析。統計處理均由SPSS 13.0統計軟件完成。

結 果

1 腎組織ACE 表達的變化

Western blotting 顯示，與WT 小鼠相比，WT +TS小鼠腎組織ACE 表達明顯增加;KO 小鼠在肢體缺血再灌注后ACE 表達進一步增加，明顯高于WT 小鼠;與WT+TS 小鼠比較，KO +TS 小鼠腎組織ACE表達也顯著增加，見圖1。

Figure 1. ACE expression in mouse kidneys of each group. Mean±SD. n=6. ##P ＜0.01 vs WT group;* P ＜0.05 vs WT+TS group.圖1 各組小鼠腎組織ACE 的表達

2 腎組織AngⅡ水平的變化

ELISA 結果顯示，與WT 小鼠相比，WT +TS 小鼠腎組織AngⅡ水平水平明顯增加;KO 小鼠在肢體缺血再灌注后Ang Ⅱ水平進一步增加，明顯高于WT小鼠;與WT + TS 小鼠比較，KO + TS 小鼠腎組織AngⅡ水平也顯著增加，見圖2。

Figure 2. AngⅡlevel in mouse kidneys of each group. Mean±SD. n=6. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs WT group;* P＜0.05 vs WT+TS group.圖2 各組小鼠腎組織AngⅡ的水平

3 MDA 含量和SOD 活性測定結果

化學比色結果顯示，與WT 小鼠相比，WT + TS小鼠腎組織MDA 含量明顯增加;KO 小鼠腎組織MDA 含量未見明顯增加，但在KO +TS 小鼠明顯高于WT+TS 小鼠，見圖3。與WT 小鼠相比，WT +TS小鼠腎組織SOD 活性明顯降低;KO 小鼠腎組織SOD 活性無明顯下降，但在KO + TS 小鼠腎組織SOD 活性明顯低于WT+TS 小鼠，見圖3。

Figure 3. MDA content (A)and SOD activity (B)in kidneys of mice. Mean ± SD. n =6. ##P ＜0.01 vs WT group;* P ＜0.05 vs WT+TS group.圖3 各組小鼠腎組織MDA 含量和SOD 活性

4 BUN 和血清Cr 測定結果

化學比色結果顯示，WT +TS 小鼠BUN 和血清Cr 含量較WT 小鼠明顯增加;與WT 小鼠相比，KO小鼠BUN 和血清Cr 含量無明顯增加，但在KO +TS小鼠BUN 和血清Cr 含量均明顯高于WT+TS 小鼠，見圖4。

討 論

早在幾十年前人們就發現不同種類的休克與RAS 系統的激活有關，它是保證重要器官如心臟、腦等血供的一種代償性反應。然而嚴重休克時RAS 系統不適當的激活對某些器官不僅不能發揮保護作用，而且還可能加重器官損傷。據文獻報道［3-4］，休克時局部器官如肺臟ACE 表達增加，ACE 增加能提高血清AngⅡ的水平，過量的AngⅡ通過增加氧自由基的釋放加重器官損傷。盡管幾十種ACE 抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑挽救和延長了許多心血管患者的生命，但在休克患者和動物的應用效果報道不一［5-6］。

Figure 4. Content of BUN (A)and serum Cr (B)in mice of each group. Mean ± SD. n = 6. ##P ＜0.01 vs WT group;* P ＜0.05 vs WT+TS group.圖4 各組小鼠TS 前后BUN 和血清Cr 的含量

目前認為RAS 還存在另外一條ACE2 催化的舒血管通路［7］，2 條通路相互拮抗、相互調節，循環RAS主要發揮調節血壓、維持水電平衡作用，而局部RAS在組織損傷修復中發揮主要作用。研究發現，具有抗炎作用的活性蛋白C 通過降低腎ACE 和提高腎ACE2 的表達減輕LPS 誘導的腎損傷［8］;血管緊張素1 型(angiotensin type 1 receptor，AT1)受體阻斷劑也可以通過抑制ACE2 的降低改善內毒素休克誘導的肺損傷［9］。這些資料表明，休克的發生不僅出現ACE 表達變化，而且負調控分子ACE2 表達變化也參與了休克的發生。

ACE 可催化AngⅠ生成AngⅡ，而ACE2 可將AngⅡ降解為Ang(1-7)。但在RAS 復雜的反應通路中，還存在其它催化途徑。ACE2 不僅能降解AngⅡ，還能將AngⅠ轉化成Ang(1-9);糜蛋白酶、組織蛋白酶A 也可以催化AngⅠ生成AngⅡ;除了ACE2，其它脯氨酰內肽酶、脯氨酰羧肽酶也將AngⅡ降解為Ang(1-7)［10］。因此，組織AngⅡ水平可能受多種酶催化反應的影響。我們研究發現，小鼠TS 后，腎組織ACE 表達增加，小鼠TS 后AngⅡ水平明顯上升;ACE2 KO 小鼠TS 前AngⅡ水平增加，TS 后AngⅡ水平進一步增加，明顯高于WT +TS 小鼠AngⅡ水平。這些結果表明，TS 時腎組織ACE 表達增加是引起AngⅡ升高的主要原因，而ACE2 基因的缺失通過降低AngⅡ分解進一步提高AngⅡ，從而影響休克的發生和進展過程。

多數學者認為，休克后多器官損傷的發生是全身炎癥反應累及局部器官所致。止血帶休克時大量的活性氧代謝產物從局部缺血組織釋放，激活了一些內源性的炎癥介質如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)等，炎癥失控導致多器官氧化應激損傷［11］。文獻報道，AngⅡ的輸注可明顯提高腎組織TNF-α 等炎癥介質的表達，而給予ACE 抑制劑可使TNF-α 的過表達消失［12］;ACE2 可以抑制AngⅡ升高引起的氧化應激和炎癥反應［2］;ACE2 缺失促進糖尿病小鼠腎的氧化應激損傷，并與ACE 表達上調有關［13］;高血壓腎病的患者AngⅡ可通過AT1受體介導的信號轉導機制上調ACE 并下調ACE2 的表達［14］。我們的研究發現，ACE2 基因敲除上調了小鼠ACE/AngⅡ的表達，但尚不足以引起腎的氧化應激損傷，而休克后的ACE2 基因敲除小鼠由于大量AngⅡ的產生，加重了腎的氧化應激反應和功能損傷。根據文獻和我們實驗結果分析表明，ACE 與ACE2 是休克誘導腎損傷中一對作用相反的重要調節因子。

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