丹參素干預對肺纖維化大鼠TGF-β1 /Smads信號通路的影響*

秦 靜， 趙銘山， 李 君

(濱州醫學院附屬醫院呼吸內科，山東 濱州256603)

肺纖維化是一種嚴重危害人類健康的疾病，預后極差，流行病學調查發現，5 年生存率＜50%，中位生存期為2.8 年［1］，目前臨床上仍以糖皮質激素和免疫抑制劑及細胞毒性藥物為主，但療效均不理想，且具有明顯的毒副作用［2］。近期研究發現丹參素(Danshensu，DA;即3，4-二羥基苯基乳酸，3，4-dihydroxyphenylacetic acid)能夠增加肺組織超氧化物歧化酶活性，減少丙二醛、羥脯氨酸含量，對肺纖維化有一定的干預作用，而且尚未發現丹參素對人體有明顯的不良反應［3］，因此本研究利用博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導的大鼠肺纖維化模型進一步來觀察丹參素對肺纖維化的干預作用以及相關細胞因子的改變。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體重(200 ±10)g，購于山東綠葉制藥有限公司，飼養于濱州醫學院實驗動物中心。

1.2 藥物與試劑 博萊霉素(每支15 mg，日本化藥株式會社，批號為201560)，地塞米松(dexamethasone，DXM)磷酸鈉注射液(每支5 mg，濟南利民制藥，批號為11011115)，注射用丹參素鈉(每支150 mg，山東綠葉制藥，批號為050208)，Masson 染色試劑盒(南京建成)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，Maxima SYBR Green/Rox qPCR Master Mix (Fermentas)，兔抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Sigma)，二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3 主要儀器 病理圖像分析系統Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics)，PCR 擴增儀(Perkin Elmer，9600 型)，實時熒光定量PCR 儀(澳大利亞Corbett，Rotor Gene 3000 型)。

2 方法

2.1 動物模型的建立、分組與標本處理 按隨機數字表法將40 只SD 大鼠分為4 組，每組10 只。其中3 組為博來霉素誘導肺纖維化模型組，參照Thrall 等報道的方法將博萊霉素5 mg·kg-1氣管內一次性滴注復制大鼠肺纖維化模型，分為BLM 組、DXM 組和DA 組;另一組為正常對照(normal control，NC)組，同時間按同樣方法氣管內滴注0.2 mL 生理鹽水。次日起，DA 組和DXM 組大鼠分別腹腔注射丹參素15 mg·kg-1·d-1和地塞米松1 mg·kg-1·d-1，BLM組和NC 組腹腔注射0.2 mL·d-1生理鹽水。所有動物于造模后第28 天解剖分離肺組織，右肺置于4%多聚甲醛固定后制備4 μm 石蠟切片供病理學檢查(HE 染色及Masson 染色)及免疫組化，左肺組織投入液氮中保存。

2.2 肺組織病理學改變 HE 染色評定肺組織肺泡炎程度，Masson 染色評定肺組織纖維化程度。行常規HE 染色及Masson 染色。Masson 染色操作嚴格按照Masson 染色試劑盒產品說明書進行，藍色的膠原纖維為陽性染色，并用Image-Pro Plus 6.0 專業圖像分析軟件系統采集肺組織Masson 染色圖像，隨機取染色區域6 個高倍視野(×100)，測量并記錄每個視野陽性染色的面積(μm2)進行半定量分析。

2.3 免疫組織化學測定肺組織α-SMA 表達 按即用型免疫組織化學試劑盒說明書(SP 法)操作。常規脫蠟至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉;Ⅰ抗:兔抗鼠α-SMA 單克隆抗體(1∶400);Ⅱ抗:生物素化山羊抗兔IgG;DAB 顯色;常規蘇木素復染;脫水、透明、封片。用PBS 代替Ⅰ抗進行免疫細胞化學染色，結果作為陰性對照。使用Image-Pro Plus 6.0 專業圖像分析軟件系統采集肺組織免疫組織化學圖像，將肺組織各切片隨機取染色區域6 個高倍視野(×400)，測量并記錄每個視野陽性染色的平均積分吸光度(IA)。

2.4 實時熒光定量PCR 測定轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1) 、Smad3 及Smad7 mRNA 的表達 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司提供。TGF-β1上游引物5'-ctgctgacccccactgatac-3'，下游引物5'-ctgtattccgtctccttggttc-3'，產物長度90 bp;Smad3 上游引物5'-gctttgaggctgtctaccagtt-3'，下游引物5'-tccctttactcccagtgtctct-3'，產物長度233 bp;Smad7 上游引物5'-tgctgtgcaaagtgttcaggtg-3'，下游引物5'-ccatcgggtatctggagtaagga-3'，產物長度177 bp;β-actin 上游引物5'-gagagggaaatcgtgcgtgac-3'，下游引物5'-catctgctggaaggtggaca-3'，產物長度453 bp。TRIpure 試劑提取大鼠肺組織總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書提供的方法進行逆轉錄，再以cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR 擴增。PCR 反應條件:95℃10 min ，1 個循環;95 ℃15 s ，60 ℃60 s，40 個循環。PCR 實驗數據分析采用相對定量方法，用內參照β-actin 作為標準，計算方法選擇2-ΔΔCt法。

3 統計學處理

利用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(mean ±SD)表示，組間均值比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 肺組織病理學改變

HE 染色結果顯示，NC 組大鼠肺組織結構輪廓完整清晰，肺泡壁薄而光滑，未見炎性細胞浸潤;BLM 組大片肺泡結構破壞或萎陷，肺泡間隔明顯增厚，形成多發片狀實變，實變組織內可見大量炎性細胞浸潤;DXM 組部分肺泡結構塌陷，肺泡間隔增厚，炎癥較NC 組嚴重，但較BLM 組明顯減輕;DA 組肺泡結構仍存在，肺泡間隔增厚不明顯，炎癥較BLM組和DXM 組均明顯減輕，見圖1。

Figure 1. Histopathological changes of lung tissues of rats in each group (HE staining，×100).圖1 各組大鼠肺組織病理學改變

Masson 染色結果顯示，NC 組肺血管壁和氣管周圍及肺泡間隔可見少量藍色的膠原纖維沉積，為肺間質的正常組成成分;BLM 組肺血管壁、支氣管壁和肺泡間隔均可見大量片狀或束狀的膠原纖維沉積，并可見大量藍色膠原沉積于肺泡腔，形成典型的間質纖維化改變，與NC 組比有顯著差異(P ＜0.01);DXM 組肺血管壁與支氣管壁的膠原纖維主要表達在肌層下，肺泡間隔膠原纖維表達較BLM 組顯著減少(P ＜0.05);DA 組肺組織也有藍染的膠原纖維表達，較BLM 組顯著減少(P ＜0.01)，較DXM組也顯著減少(P ＜0.01)，見圖2。4 組大鼠陽性染色面積的比較見表1。

Figure 2. Collagen deposition of lung tissues of rats in each group (Masson staining，×100).圖2 各組大鼠肺組織膠原沉積

2 肺組織α-SMA 表達

免疫組化結果以細胞中出現棕黃色顆粒為α-SMA 陽性顯色。NC 組肺組織的較大血管平滑肌和氣道平滑肌偶見α-SMA 陽染細胞;BLM 組肺組織可見大量α-SMA 陽染細胞，形成典型的成纖維細胞灶，與NC 組有顯著差異(P ＜0.01);DXM 組肺組織仍可見成纖維細胞灶存在，但α-SMA 陽染細胞較BLM 組明顯減少(P ＜0.05);DA 組肺組織未見成纖維細胞灶，α-SMA 陽染細胞較BLM 組明顯減少(P ＜0.01)，較DXM 組也明顯減少(P ＜0.05)，見圖3。各組IA 值比較見表1。

3 肺組織TGF-β1、Smad3 和Smad7 mRNA 的表達

BLM 組TGF-β1和Smad3 mRNA 的表達顯著高于NC 組(均P ＜0. 01);DA 組TGF-β1和Smad3 mRNA 的表達較BLM 組顯著降低(均P ＜0.01)，但較NC 組升高(均P ＜0.05)。BLM 組Smad7 mRNA的表達顯著低于NC 組(P ＜0. 01);DA 組Smad7 mRNA 的表達較BLM 組顯著升高(P ＜0.01)，但仍低于NC 組(P ＜0.01)，見表2。

Figure 3. Immunohistochemical staining of α-SMA in lung tissues of rats in each group (×400).圖3 各組大鼠肺組織α-SMA 的免疫組化染色

表1 各組大鼠肺組織膠原纖維面積和肺組織α-SMA 蛋白表達的比較Table 1. Area of collagen and expression of α-SMA protein in lung tissues of rats in each group (mean±SD.n=18)

討 論

丹參素是從丹參水提液中分離得到的一種有效成分，近年來被廣泛應用于對肝纖維化的研究。多項研究結果顯示丹參素對肝纖維化有明顯的治療作用［4］，但對肺纖維化形成階段的治療作用及其機制尚未完全清楚。本研究通過博來霉素誘導大鼠肺纖維化模型后，在肺纖維化形成階段給予丹參素進行干預，結果發現丹參素可減輕大鼠肺泡炎和肺纖維化的嚴重程度，表明丹參素具有抗肺纖維化形成的作用，有可能成為新的抗肺纖維化的藥物，但還需要進一步研究。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 和Smad7 mRNA 的表達Table 2. The mRNA expression of TGF-β1，Smad3 and Smad7 in lung tissues of rats in each group (mean±SD.n=9)

成纖維細胞灶是特發性肺纖維化的主要病理學特征之一［5］。成纖維細胞灶主要由肌成纖維細胞(myofibroblasts，MFb)構成，其合成膠原纖維的能力是成纖維細胞(fibroblast，Fb)的4 ～5 倍，是造成細胞外基質異常沉積的主要效應細胞［6］。由于α-SMA是Fb 向MFb 轉化的標志性蛋白［7］，因此對α-SMA蛋白表達水平的檢測可以間接地反映MFb 的增殖。本實驗結果表明，α-SMA 在DA 組大鼠肺組織中的表達水平較BLM 組顯著降低，表明丹參素能夠阻止以表達α-SMA 為主的MFb 形成，從而減緩大鼠肺纖維化的形成。

在眾多致纖維化細胞因子中，TGF-β1被公認是最重要的調控因子，有研究表明TGF-β1mRNA 在肺纖維化大鼠肺組織中明顯升高［8］。TGF-β1能刺激未成熟成纖維細胞生長，促進Fb 遷移、增殖，誘導Fb 表型轉換為MFb，繼而促進膠原蛋白等細胞外基質在肺間質和肺泡間過度積聚，從而導致肺纖維化的發生與發展［9］。本研究發現，TGF-β1mRNA 在DA組肺組織中的表達程度較BLM 組顯著降低，提示丹參素的抗纖維化作用可能部分是通過抑制TGF-β1進而減少肺組織中表達α-SMA 的肌成纖維細胞的數量來實現的。

TGF-β1的致肺纖維化效應主要通過Smads 信號通路轉導。Smads 是TGF-β1與其細胞膜上的受體結合后的胞內激酶底物，介導了TGF-β1的細胞內信號轉導，其中Smad3 促進纖維化的形成，Smad7 卻是TGF-β1信號轉導途徑的主要抑制性蛋白［10］。因此，本實驗選擇Smad3 和Smad7 為觀察指標，初步探討丹參素抗纖維化作用的可能機制。本研究發現，BLM 組大鼠肺組織中Smad3 mRNA 表達升高，Smad7 mRNA 表達降低，提示博萊霉素可能激活了TGF-β1/Smads 信號通路，從而使肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化;經丹參素干預后，大鼠肺組織Smad3 mRNA 表達下調，而Smad7 mRNA 上調，提示丹參素可能通過影響成纖維細胞Smad3 和Smad7 mRNA 的表達，抑制TGF-β1/Smads 信號途徑，從而發揮抗肺纖維化作用。

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