ICAM-1在兒童腫瘤中表達的臨床意義

黃 珂 陳艷紅

近年來，在兒童腫瘤中應用以細胞因子誘導殺傷(cytokine-induced killer，CIK) 細胞輸注為主導的細胞過繼免疫治療已經逐漸受到重視。與CIK細胞殺傷激活關系密切的細胞間黏附分子-1( intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1，CD54)的研究越來越得到關注。腫瘤細胞表達的 ICAM-1與 CIK 細胞上表達的淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1) 相互作用是 CIK 細胞殺傷、識別腫瘤細胞的主要機制。本研究擬檢測兒童腫瘤細胞 ICAM-1 表達水平并分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2008年1月1日-2012 年12 月31日收治的兒童腫瘤患者共85例，分為實體瘤和非實體瘤(白血病)。實體瘤35例，其中淋巴瘤10 例，肝母細胞瘤2例，神經母細胞瘤4例，橫紋肌肉瘤2 例，尤文氏肉瘤4例，原始神經胚層腫瘤4 例，腎母細胞瘤9 例。非實體瘤指急性白血病(acute leukemia，AL)50例，包括急性淋巴細胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL) 20 例和急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML) 30 例。AML中部分分化性粒細胞性白血病(M1)、分化性粒細胞性白血病(M2)、早幼粒細胞性白血病(M3) 型共 18 例，粒單細胞性白血病(M4)、單核細胞性白血病(M5)型共12 例。所有患兒均進行骨髓象形態學和細胞化學、細胞免疫分型檢測和確診。選取健康移植供者骨髓20 例作為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測方法 ①實體瘤：手術切取患兒腫瘤實體組織制取的石蠟切片，采用免疫細胞化學方法檢測切片組織的 ICAM-1 表達水平。組織切片常規二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，放入新配制的 3% 過氧化氫甲醇 37℃孵育10 min，阻斷滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水洗 3 次。微波修復抗原，滴加血清封閉液 20 min。滴加 ICAM-1 一抗4℃冰箱孵育 60 min，用 PBS 沖洗3～5 min，滴加生物素標志的 IgG 二抗37℃孵育20 min，滴加SABC(鏈霉卵白素+ 辣根酶標記生物素) 20 min，DAB染色液 10 min顯色，蘇木精染色液染色 5 min，常規進行脫水、透明、干燥、封片。②白血病：取流式細胞儀(FACSCalibur)專用試管 1 支，加入多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物(Percp)標記的 CD45 單克隆抗體10 μl/孔，再加入藻紅蛋白(PE )標記 ICAM-1 單克隆抗體10 μl/孔，加入 EDTA-K2抗凝的骨髓 50 μl/孔，低速渦流混勻，37℃避光反應 20 min。加入BD FACS lysing solution溶血素 1 ml，混勻，37℃避光保存10 min。37℃條件下取180 g 離心 5 min，棄上清液，再加入 PBS 2 ml，均勻混合后取180 g 離心 5 min，棄去上清液。加入 1% 多聚甲醛 0.5 ml，均勻混合，在1～4 ℃ 保存，待檢測。FACSCalibur 流式細胞儀的開機、關機等操作嚴格按照說明書進行。開機后啟動 FACSComp 軟件，標準熒光微球(calibration beads)校正儀器后，以 CellQuest Pro數據獲取分析軟件獲取數據。每管檢測10 000 個細胞，采用 CD45 / SSC 設門，分析白血病細胞群中 ICAM-1 陽性表達水平。③對照組：分別取正常骨髓淋巴細胞、粒細胞及單核細胞檢測的 ICAM-1 表達水平。

1.2.2 判斷標準 根據顯微鏡下觀察到的棕黃色陽性細胞數進行判斷，陰性(-):未觀察到棕黃色陽性細胞；出現棕黃色陽性細胞本研究均定義為陽性。

1.3 統計學處理

采用SPSS20.0統計軟件包對數據進行統計分析。ICAM-1(CD54)表達采用百分數表示，應用描述性統計方法分析。患兒和正常兒童血液中ICAM-1(CD54)表達水平的比較采用列聯表資料χ2檢驗。

2 結果

2.1 ICAM-1(CD54)在患兒腫瘤組織中的表達

肝母細胞瘤ICAM-1檢出100.0%(2/2)，其他檢出ICAM-1的腫瘤有淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、尤文氏肉瘤，而腎母細胞瘤和原始神經外胚層腫瘤未檢出ICAM-1。急性淋巴細胞白血病和急性髓系白血病檢出率分別為50.0%(10/20)和53.3%(16/30)。見表1。

表1 兒童腫瘤組織中ICAM-1(CD54)的表達水平

2.2 白血病患兒和正常兒童ICAM-1表達的比較

ALL 患兒骨髓細胞的 ICAM-1 陽性表達率為50.0%(10/20)，與對照組骨髓中淋巴細胞上 ICAM-1 陽性表達率(65.0%)比較無顯著差異，χ2=0.921，P=0.337。AML ( M1、M2 和 M3) 患兒骨髓細胞的 ICAM-1 陽性表達率為66.7% (12/18)，顯著高于對照組骨髓中粒細胞上 ICAM-1 的陽性表達率(10.0%)(χ2=15.292，P=0.000);AML ( M4、M5) 患兒骨髓細胞的 ICAM-1 陽性表達率為 33.3%(4/12)，顯著低于正常對照組骨髓中單核細胞上 ICAM-1 的陽性表達率(75.0%)(χ2=5.398，P=0.020)。

3 討論

細胞間黏附分子(ICAM-1)屬細胞黏附分子免疫球蛋白超家族[1]，是重要的炎性細胞因子，在炎癥發生與發展中起著重要作用。當組織發生炎癥反應時，內皮細胞受侵襲時其表面的ICAM-1經活化后可與白細胞表面的αLβ2及巨噬細胞表面的αMβ2相結合，使白細胞固著于炎癥部位的脈管內皮，進而分泌水解酶而穿出脈管壁，促使病變的擴散。目前ICAM-1在腫瘤細胞的侵襲、轉移及機體抗免疫功能對抗腫瘤的作用中已引起相關領域的廣泛重視。研究認為，兒童白血病患者中ICAM-1表達發生異常改變，與白血病的發生、發展及預后情況有密切聯系。ICAM-1的表達異常通過細胞毒性T細胞、NK殺傷細胞作用，ICAM-1依賴的主要組織相容性復合體類抗原免疫識別的影響而發揮作用。

機體在抗腫瘤免疫中起主要作用的是細胞免疫，ICAM-1與其配體抗淋巴細胞功能相關抗原-1( LFA-1) 結合后，主要通過激活 T 細胞、促使B淋巴細胞的分化、增強CIK細胞的腫瘤殺傷作用。CIK 細胞能同時表達CD3+和CD56+膜蛋白分子，具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點，殺傷活性可以達到 84.7%，比NK、LAK 細胞抗腫瘤作用更強[2]。CIK細胞作用機理是通過不同的機制識別腫瘤細胞，釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，導致腫瘤細胞裂解[3]。CIK細胞在培養過程中表達FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)，通過與腫瘤細胞膜表達的Fas(Ⅰ型跨膜糖蛋白)結合，誘導腫瘤細胞凋亡。體外培養的CIK細胞可以分泌多種細胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用，還可通過調節機體免疫系統反應性間接殺傷腫瘤細胞[4]。

腫瘤細胞上 ICAM-1 表達數量決定了其對CIK 細胞的殺傷是否敏感。本次研究顯示，ICAM-1 在AML 骨髓細胞上的表達與對照組比較差異明顯;在 M1、M2和 M3 型AML 骨髓細胞上表達高于對照組，而 M4 和 M5 型 AML 骨髓細胞上表達顯著低于對照組。這與熊稀霖等[2]的研究結果基本一致，M1、M2和 M3 型AML對CIK細胞抗腫瘤作用效果明顯。國外研究認為，CIK 細胞的細胞毒活性可被抗 LFA-1 或 ICAM-1 的單克隆抗體所阻滯，這進一步提示細胞表面黏附分子ICAM-1在 CIK 細胞識別腫瘤過程中起關鍵作用[2]。

也有研究顯示[5]，ICAM-1與LFA-1和Mac-1結合可以抑制細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞的激活與信號的傳遞，使細胞毒性T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的活性降低，導致腫瘤細胞逃避機體的細胞免疫監視。同時，ICAM-1過度活化可產生大量的sICAM-1進入血液，通過對ICAM-1依賴的主要組織相容性復合體類抗原免疫識別競爭性抑制作用，使腫瘤細胞躲避機體的免疫監視，發生腫瘤的侵襲和轉移。表達 ICAM-1 的腫瘤細胞與淋巴細胞的黏附性增強，隨著淋巴細胞移動，引起腫瘤細胞的擴散和轉移。研究發現[6-7]，大腸癌、肺癌細胞表面ICAM-l的過度表達與淋巴結轉移密切相關。胃癌細胞表面高表達ICAM-1分子，其產生的sICAM-l可促進癌細胞的血源性轉移。

總之，兒童腫瘤細胞ICAM-1分子的表達與CIK細胞免疫殺傷腫瘤細胞有關，高表達 ICAM-1分子的腫瘤細胞易受到CIK 細胞抗腫瘤作用。患兒腫瘤細胞ICAM-1分子高表達也可能發生腫瘤遠處轉移。參考兒童腫瘤ICAM-1的水平，可對病情進行合理地判斷，選擇適宜的免疫治療方案。高表達ICAM-1的腫瘤患兒應考慮積極使用 CIK 細胞免疫治療[8]。

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