宮頸細胞DNA倍體分析制片及診斷體會

【摘要】 目的 探討影響宮頸細胞DNA定量檢測診斷的相關因素，做好質控，為作出準確細胞病理學診斷提供技術保障。方法 回顧性分析2010年7月以來我院宮頸細胞DNA倍體分析病例資料，查找標本取材、制片、染色、掃描、數據處理、結果判斷等環節影響診斷質量的因素。結果 正確的標本取材和保存、技術室的溫度控制、制片質量、染液配制和染色時間、計算機掃描系統的設置、診斷者的經驗值等均是影響診斷結果的因素。結論 加強質控是做出正確診斷的重要保證。

【關鍵詞】 病理診斷；DNA定量檢測

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.145 文章編號：1004-7484（2012）-08-2532-01

早期發現或意外發現宮頸上皮內瘤變及宮頸癌，使死亡率明顯下降[1]。宮頸DNA倍體分析是目前比較先進的宮頸癌早期檢測技術，它能比常規細胞學檢查更早發現細胞病變，在宮頸癌前病變診斷具有很高的臨床價值。由于宮頸DNA倍體分析是一項要求較高的DNA定量分析技術，其制片質量、計算機掃描及數據處理等對結果判斷影響極大，因此認真做好各個環節質控是開展好宮頸DNA倍體分析檢測的前提和必要條件。現將我院2011年7月開展工作的情況報告如下：

1 材料和方法

1.1 材料 2010年7月以來，我院開展宮頸DNA檢測的病例。

1.2 取材 受檢者取截石位，用宮頸刷從子宮頸內采取足夠數量的細胞樣本。將宮頸刷插入子宮頸管內，直到只有刷子最下面的刷毛暴露在子宮頸外口為止。慢慢將宮頸刷向同一方向轉3-5圈，取出宮頸刷，拔下刷頭，浸泡在樣本保存液中。

1.3 制片 離心滴片法制成薄層細胞玻片。干燥。

1.4 染色 將切片置B.S固定液中固定50min；流水洗滌4-5次；5N鹽酸酸解1小時（室溫，25±2℃）；流水洗滌4-5次；將切片置Feulgern染液中染色75min（室溫，25±2℃）；流水洗滌4-5次后，水中繼續浸洗15min。

1.5 脫水 置50%-75%-100%-100%-100%酒精中逐級脫水，各1min。

1.6 濕式封片 切片迅速依次轉入無水乙醇：二甲苯（1：1）-100%二甲苯-100%二甲苯，各1-3分鐘；最后一張一張取出，滴加中性樹膠封片。

1.7 圖像掃描 調整參數設置到符合當前所要掃描切片的要求。放置一張切片在載物臺上，用條形碼讀取器讀取條形碼，此時載物臺移至掃描起始點。點擊操作布局中的“開始掃描”，系統開始掃描。

1.8 數據處理及發放報告 甄別倍體異常細胞，去除垃圾細胞，對數據進行分析處理，打印報告。

2 結 果

2010年7月以來，我院共開展宮頸DNA檢測7358例。診斷陽性272例，可疑391例，行組織活檢406例，檢出宮頸CIN79例、宮頸癌25例，陽性預期值達25.6%。7358例中，因重感染期取材細胞核溶解出現左、右邊峰158例，因染色致IOD值偏高或偏低重制片334例，標本細胞數量少重取材78例，掃描系統校正當誤差7次，數據處理未標準化11次，圖形分析和病變細胞判斷誤差23例。

3 討 論

DNA異倍體是腫瘤細胞形成過程的一個生物標記，采用全自動細胞DNA倍體分析，是目前判斷宮頸上皮內瘤變（CIN）發展狀態方法之一，國際上不僅將全自動細胞DNA倍體分析系統用于宮頸癌的診斷，還用于判別宮頸癌的惡性程度及預測宮頸疾病的發展狀態[2]。標本取材時間和方法、制片和染色質量、布局設置和參數選擇、數據處理、結果判斷等環節均可影響診斷質量，必須強化質控，對不利因素加以控制，正確分析判斷，才能保證結果的準確性。

3.1 標本的可用是制片質量的保證 要選擇好取材時間，掌握好取材方法，排除粘液和血液的干擾，保證有足夠的宮頸細胞。

3.2 不固定的組織細胞，DNA在水解過程中容易丟失。另一方面，固定可封閉組織細胞內的自由醛基。因此，標本取好后應立即放入保存液內。要把握好振蕩的強度和時間達到基本打散細胞團，保證標本的均一性；掌握好離心轉速和時間，正確清洗，保證既能去掉黏液和一些較小的炎性細胞，又不至于破壞細胞。

3.3 滴片的好壞影響染色效果 要做到標本細胞居中、大小適宜、分布均勻。

3.4 試劑、染液和實驗室的條件均是影響染色的因素，必須控制好。要把握好試劑配制的時間和濃度，染液、BS固定液及鹽酸不重復使用，現配現用；把握好實驗室的溫度和溫度等條件，保證攪拌、過濾、染色盡量在同一溫度下進行，否則攪拌時已經溶解的染色劑會由于溫度降低而被析出，造成結晶，影響染色與掃描結果；在配制染液時，磁力攪拌子形成的漩渦高度在2cm左右會較好，且漩渦應均勻，不要有氣泡產生，否則會將空氣引入染液。染色時間和水洗要適度。

3.5 脫水和封片 從脫水到封片過程中要迅速，防止切片在濕空氣中吸取水分，出現云霧狀。蓋玻片要貼正，四周無樹膠堆積或溢出，無氣泡及因細胞干燥引起的收縮所形成的胞質內褐色皺折。

3.6 設置對照組及標準化 由于影響染色的因素很多，為了保證每次結果的準確性，可用豬肝片，作為每次染色的對照組。如果在同一時間由相同豬肝片，在不同時間染色后IOD結果相差不大，說明前后染色條件相近，結果較為一致。若IOD結果相差較大，說明染色過程中出現問題，將直接影響診斷結果。因此掃描前必須先分析標準片，做好質控記錄，完成標準化過程。

3.7 排除干擾因素，必要做鏡下復核 一些生物、化學物理因子可影響細胞核的DNA含量，如病毒感染（HPV、HIV），VitB12缺乏，放射線等因素均可引起DNA含量的變化[3]，因此在診斷癌前病變時，一定要將上述因素排除。此外，還應正確處理掃描數據，甄別垃圾、核重疊等假陽性細胞和異常增生，可疑病變細胞應做好鏡下復核。

參考文獻

[1] Grote HJ，Nguyen HV，Leick AG，et al.Identification of Progressive cervical epithelial cell abnormalities using DNA imagecytomertry[J].Cancer，2004，102：373-379.

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[3] 孫小蓉，汪鍵，等.DNA定量細胞學.湖北：科學技術出版社，2006：55.