不同抗原修復液和固定時間對免疫組化結果的影響

【摘要】 目的 針對不同的抗原修復液與時間對免疫組化所產生的影響進行探討。方法 取出26例乳腺浸潤性導管癌標本試樣。其中的每例中附著4個時間點，這四個時間點組分別為：立即固定組，延遲12小時固定組，延遲24小時固定組和延遲48小時固定組。依次對所選取4塊腫瘤組織，在腫塊部位進行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片等相關操作，利用行HE染色方法驗證試驗中的腫瘤組織，再通過抗原修復液展開免疫組化驗證實驗。結果 CK7、ER和C-erbB-2在4組試樣在不等的時間和不同的抗原修復液的乳癌組織間表現出了不同的效果，并且結果的差異可以從統計學角度進行分析。結論 在本實驗中，所進行延遲固定的組織，在通過充分固定和進行選取抗原修復液A[高溫高壓EDTA（pH9.0）緩沖液修復）]、抗原修復液B[高溫高壓EDTA（pH8.0）緩沖液修復]、抗原修復液C[高溫高壓檸檬酸鹽（pH6.0）緩沖液修復]和抗原修復液D[微波爐EDTA（pH9.0）緩沖液修復法]的前提下能夠進行免疫組化檢測，但需要注意的是盡量減少和避免延遲固定時間。

【關鍵詞】 抗原修復液；固定時間；免疫組化

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.089 文章編號：1004-7484（2012）-08-2487-02

隨著醫學技術和相關領域的不斷發展，免疫組織化學技術作為一門新興的學科出現了。它是一門基于免疫和分子生物學與病理形態學等學科綜合的技術，主要是通過已知抗體或抗原進行對實驗中的組織細胞中探測的抗原或抗體檢測。典型特征包括操作易于實現，準確性高和特異性強，并且能夠將形態和機能相互整合。該種技術已在實際中能夠進行病理和鑒別診斷，組織胚胎和神經解剖等相關領域的實驗研究[1]。通常情況下，只有在正確及時的固定離體組織前提下，免疫組化技術才能得出精確度高的實驗結果。但是，由于實際操作中存在大量的影響因素造成不能正確及時的固定離體組織，特別是在進行尸檢標本時，對實驗的要求更高。本文的研究重點就是考察這些組織是否能夠做免疫組化實驗，對于不同抗原修復液和固定時間對免疫組化結果的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 采集本院在2008年1月至2009年12月手術中送檢，并且確診為乳腺浸潤性導管癌的26例標本。在實驗中，每一標本中選取4塊腫塊部位，其中的四個時間點分別是：t1，t2，t3和t4。t1，t2，t3和t4分別代表立即固定組，延遲12小時固定組，延遲24小時固定組，延遲48小時固定組。將其中的1塊標本馬上置于10%的中性福爾馬林液中進行固定，并將實驗中的其余3塊分別于延遲12、24、48小時后放入10%中性福爾馬林液進行固定。然后對于以上標本固定滿24小時后進行脫水、透明、浸蠟和包埋相關操作，再進行切片行HE染色驗證腫瘤組織。并且將染色結果為陰性者立即固定組免疫組化，同時不再做與其相應延遲固定組的標本標記染色。

1.2 試劑與方法 采用的試劑包括：鼠抗人CK7單抗，抗人C-erbB-2，單抗兔抗人ER單抗和鼠及ElivisionTM plus（即用型檢測試劑盒和DAB試劑盒均購于福建邁新生物技術開發有限公司）。采用兩步法進行免疫組化，即分別用檸檬酸高壓熱修復和胃酶修復，并且嚴格按照ElivisionTM plus試劑盒要求的操作步驟進行操作。其中，脫水透明，中性樹膠封片，DAB顯色和蘇木素輕度復染，并且用PBS進行替換一抗作為陰性對照。其中，不同抗原修復液分組：pH為9.0的高溫高壓EDTA緩沖液修復（A），pH為8.0高溫高壓EDTA緩沖液修復（B），pH為6.0高溫高壓檸檬酸鹽緩沖液修復（C），pH為9.0微波爐EDTA緩沖液修復（D），pH為8.0微波爐EDTA緩沖液修復（E），pH為6.0微波爐檸檬酸鹽修復法（F）。

1.3 結果判定 進行陽性定位在細胞漿和陽性定位在細胞核的免疫組化切片，將其中具有特征代表的10個在400倍視野中觀察，對其中的陽性細胞占整體細胞的比例進行計數如下：計陽性細胞數占整體細胞比例在25%以下記做（±），占整體細胞比例在25%-50%記做（+），占整體細胞比例在50%-75%記為（++），占整體細胞比例在75%以上記為（+++），并且相應的評價分為1，2，3，4分；同樣的，以（±），（+），（++）表示染色強度，并且相應的評價分為1，2，3分。最后，將兩種記分乘積作為染色效果指數。另外，對陽性定位于細胞膜的免疫組化進行切片，其中的染色效果參照文獻[2]標準判定，同樣的以符號±，+，++，+++，++++進行評價，并且相應的評價分為1，2，3，4，5分，將兩種分數的乘積作為染色效果指數。

1.4 統計學分析 基于統計軟件SPSS13.0進行數字統計處理。在進行統計中，進行隨機區間設計的秩和檢驗，并將檢驗結果在P<0.05作為有效結果處理。

2 結 果

2.1 通過在A-F抗原修復液以及固定時間不同乳癌組織中，CK7的表現結果如下：在乳癌組織中，CK7的陽性顯示為黃褐色的顆粒，其定位于細胞漿中，在總共26例標本中立即固定組均陽性。并且，在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數差異，有統計學意義（P<0.01）。并且隨著固定時間的增長其背景染色也逐漸的增強。此外，在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組，通過依次采用抗原修改方法A、B、C、D、E到F間的染色效果指數，差異有統計學意義（P<0.01）。并且四組標本采用抗原修改方法A、B、C、D、E到F，背景染色依次增強。

2.2 通過在A-F抗原修復液以及固定時間不同乳癌組織中，ER的表現結果如下：在乳癌組織，ER的陽性顯示為黃褐色顆粒，其定位于細胞核中，在所有的標本中有22例立即固定組標本呈現出了陽性。在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數之間的差異P<0.01，有統計學意義。并且隨著固定時間的增長固定組背景染色逐漸增長，并且陽性定位于在細胞漿中。此外，立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組，通過依次采用抗原修改方法A、B、C、D、E到F間的染色效果指數，差異有統計學意義（P<0.01）。并且四組標本采用抗原修改方法A、B、C、D、E到F，背景染色依次增強。

2.3 通過在A-F抗原修復液以及固定時間不同乳癌組織中，C-erbB-2的表現結果如下：在乳癌組織，C-erbB-2陽性顯示為黃褐色顆粒，并且陽性定位在細胞膜中，在所有的標本中有18例立即固定組標本呈現陽性。在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數之間的差異P<0.01，有統計學意義。但是，在48小時后固定組細胞膜陽性難以辨認。并且隨著固定時間的增長固定組背景染色逐漸增長。此外，立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組，通過依次采用抗原修改方法A、B、C、D、E到F間的染色效果指數，差異有統計學意義（P<0.01）。其中，采用抗原修改方法E和F細胞膜陽性難以辨認。并且四組標本采用抗原修改方法A、B、C、D、E到F，背景染色依次增強。

3 討 論

由組織病理學基本理論可知，無論在組織切片活著進行電鏡大體標本的保存，應該及時適當進行有效的固定。通過這種操作，才能達到使組織和細胞內蛋白凝固并能夠在特定位置保留，進而可以防止破壞及自溶內外源性酶，從而最大程度的對組織和細胞的固有形態、結構實施了保護。當出現組織內沒未能進行有效的固定時，內外源性酶將能夠造成組織細胞結構破壞，甚至使某些特定部位的蛋白向周圍擴散并出現降解。在本實驗中，通過采用不同抗原修復液，并采用在延遲時間不等的固定組織，進行特定部位的蛋白免疫組化檢測，在結果中可以看到特定陽性部位周圍有不同的化程度的陽性背景。并且，在進行CK7免疫標記時，癌巢周圍陽性背景隨著抗原修復液A到F，固定時間的增長而逐漸加深；在進行ER免疫標記過程中，在核陽性減弱的同時出現胞漿的陽性背景；在進行C-erbB-2免疫標記過程中，胞膜陽性同時胞膜兩側均出現陽性背景。并且，從統計學角度，在CK7、ER和C-erbB-2在4組固定時間不等的乳癌組織間的表達效果具有統計意義。

免疫組織化學技術基本原理：基于抗原抗體反應或者組織化學的呈色反應，通過借助顯色劑來標記特異性抗體在組織細胞原位，從而能夠對相應抗原進行定性、定位和定量診斷。其中，組織固定不理想對于免疫組化染色結果有非常大的關系，其固定的結果程度和抗原保存有直接關系，因此應該進行盡快組織固定。在進行大標本和有包膜的標本實驗時，由文獻[3，4]應該進行切開固定。在其中的組織細胞不能及時有效固定，就會導致細胞內蛋白破壞降解，甚至導致免疫組化檢測失敗[5，6]。免疫組化染色中，組織結構的保存和抗原性等的改變程度有多方面的影響因素，主要包括：溫度、抗原、固定液的pH值、固定劑種類、灌注速度和進行固定后處理方法等方面。

在本實驗中，所選用得CK7、ER和C-erbB-2抗體，進行了在不同抗原修復液，在立即固定、延遲12小時固定、延遲24小時固定和延遲48小時固定的4組乳癌組織中，并且最終標記了細胞漿、細胞核和細胞膜等部位的相應蛋白。通過實驗看出，在抗原修復液E和F及在延遲48小時中的不到明確的膜陽性。因此，延遲固定對膜蛋白免疫組化效果的影響更明顯。延遲固定大幅弱化了免疫組化效果，其中的原因可能是延遲固定和內外源性蛋白酶對部分蛋白的降解，以及部分蛋白向周圍擴散造成。抗原修復液E和F延遲固定太長，不太適宜進行檢測，而抗原修復液A、B、C和D可以進行延遲固定組織免疫組化檢測。可以得出，盡管在實驗中免疫組化效果變差，但是可以分辨出特定部位的陽性結果。因此，對延遲固定組織只要充分固定和選用抗原修復液抗原修復液A、修復液B、修復液C和修復液D可以做免疫組化檢測的，同時應注意減少實驗延遲固定時間。

綜上所述，對于那些客觀因素造導致延遲固定標本，在其延遲時間未達到48小時之前，并且沒有進行免疫組化輔助診斷，可以選用抗原修復液A、B、C和D進行免疫組化檢測。應當注意的，判定檢測結果應充分考慮到延遲固定帶來的影響。因此，只要通過有效的措施排除了延遲固定產生的不良影響，免疫組化在一定意義上能夠起到輔助診斷的作用。

參考文獻

[1] 楊美娟.組織標本固定方法與免疫組織化學染色效果的關系[J].解剖科學進展，2003，9（1）：89-90.

[2] D'Alfonso T，Liu YF，Monni S，et al.Accurately assessing her-2/neu status in needle core biopsies of breast cancer patients in the era of neoadjuvant therapy： emerging questions and considerations addressed[J].Am J Surg Pathol，2010，34（4）：575-581.

[3] 吳秉銓，劉彥仿.免疫組織化學病理診斷[M].北京：北京科學技術出版社，2007：10.

[4] 楊紅.免疫組化質量控制中的3個基本影響因素[J].臨床與實驗病理學雜志，2001，17（2）：183-185.

[5] 喬秀玲.不同固定液和固定時間對大腸癌淋巴結免疫組化染色的影響.細胞與分子免疫學雜志，2010，26（5）：504-505.

[6] 杜宇，官大威，趙銳，等.抗原修復法和固定液pH 值對切創皮膚免疫組化染色的影響[J].中國法醫學概論，2007，22（3）：156-159.