解讀單克隆抗體制備過程中的兩次篩選及考查例解

一、原理闡釋

“單克隆抗體的制備”是選修三“動物細胞工程”這一章的重點內(nèi)容，雖然高考對選修教材要求層次相對較低，但兩次篩選過程仍時有考查。課本中對第一次篩選這樣敘述：“根據(jù)這個設想，他們首先將抗原注射入小鼠體內(nèi)，然后從小鼠脾臟中獲得能產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞，與小鼠骨髓瘤細胞在滅活的仙臺病毒或聚乙二醇的誘導下融合，再在特定的選擇性培養(yǎng)基中，篩選出雜交瘤細胞。”學生在預習中多次會問及這是什么樣的選擇培養(yǎng)基，怎樣選擇。在誘導劑作用下，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)三種細胞，B淋巴細胞與B淋巴細胞融合，骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞融合，以及B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合，未融合的B淋巴細胞、未融合的瘤細胞，以及細胞的多聚體形式等。正常的B淋巴細胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，不需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去，而未融合瘤細胞則需進行特別的篩選去除。

在普通動物培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺密啶脫氧核苷酸制成HAT培養(yǎng)基，這是根據(jù)細胞中的DNA合成途徑有兩條：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子合成提供原料。此過程中，葉酸作為重要輔酶參與此過程，而HAT培養(yǎng)液中氨基蝶呤是葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”，氨基蝶呤這種獨特的拮抗葉酸作用，也廣泛用于醫(yī)學領域，如治療一些頑固性疾病、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬等，效果顯著。DNA的另一條合成途徑是應急途徑（“S途徑”），它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷酸轉(zhuǎn)移酶和胸腺嘧啶核苷激酶，催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸，兩種酶缺一不可。因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應B細胞和兩個融合的效應B細胞融合的“D途徑”被氨基蝶呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏體外培養(yǎng)液中增殖的能力，一般10d左右死亡。對于骨髓瘤細胞及自身融合細胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷酸轉(zhuǎn)移酶缺陷型細胞，因此，自身無“S途徑”，且“D途徑”又被氨基蝶呤阻斷，所以HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。只有瘤細胞與效應B細胞相互融合的細胞，既有效應B細胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來，并不斷增殖。

課本中對第二次篩選是這樣敘述的：“他們培養(yǎng)雜交瘤細胞，從中選出能夠產(chǎn)生所需抗體的細胞群，繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的細胞，在體外條件下，做大規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。”其中“從中選出能夠產(chǎn)生所需抗體的細胞群”這句話較為概括，學生會產(chǎn)生疑問：“已經(jīng)是效應B細胞和瘤細胞的融合體，為什么還要篩選？難道產(chǎn)生的抗體還有區(qū)別嗎？”

在單克隆抗體制備過程中，由于注射的抗原（病毒、細菌或抗原蛋白）具有多種抗原決定簇，而一種決定簇刺激機體產(chǎn)生一種效應B細胞，進而產(chǎn)生一種針對決定簇的抗體，所以經(jīng)HAT培養(yǎng)液第一次篩選出的雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體存在差異，必須對雜交瘤細胞群進行第二次篩選，選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤。二次篩選通常采用有限稀釋克隆細胞的方法，將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔細胞培養(yǎng)板上，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖，然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體，上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，繼續(xù)進行有限稀釋，一般重復3～4次，直至確保每個孔中增殖的細胞為單細胞。同時，再由這些單細胞克隆生長，最終選出分泌預定特異抗體的雜交細胞株進行擴大培養(yǎng)，第二次篩選也是鑒定過程，因此，單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的原理和方法是不同的。

二、習題舉例

例：人絨毛膜促性腺激素（HCG）是女性懷孕后胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白，制備抗HCG單克隆抗體可用于早孕的診斷。下圖是抗HCG單克隆抗體制備流程示意圖，請分析回答：

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（1）制備單克隆抗體過程中要用到（動物細胞培養(yǎng)）和（動物細胞融合）技術。

（2）制備單克隆抗體過程中，給小鼠注射的HCG相當于（抗原），使小鼠產(chǎn)生分泌相應（抗體）的淋巴細胞，此過程屬于特異性免疫中的（體液）免疫。

（3）在細胞內(nèi)DNA合成一般有兩條途徑，主途徑是在細胞內(nèi)由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，而氨基喋呤可以阻斷此途徑。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤細胞的DNA合成沒有此輔助途徑。

①利用DNA合成途徑不同的特點配制的HAT培養(yǎng)基含有多種成分，其中添加的（氨基喋呤）成分具有篩選雜交瘤細胞的作用。

②最終篩選獲得的雜交瘤細胞的特點是（能無限增殖并分泌特異性抗體）。

（4）此過程生產(chǎn)的單克隆抗體可以與（人絨毛膜促性腺激素/“HCG”）特異性結合，從而診斷早孕。