急性胰腺炎時腺泡細胞凋亡與Bax表達*

謝榮俊 張樹友 李峰 周筱筠 劉龍飛 盧先州

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常見的外科急腹癥，其發病機制尚未完全闡明。最近發現，胰腺腺泡細胞凋亡與AP的發生、發展及轉歸密切相關，使之成為當前的研究熱點。Bax是廣受關注的凋亡相關基因，可促進細胞的凋亡，但目前國內外關于Bax與AP時腺泡細胞凋亡的研究鮮有報道。本研究旨在探討AP時腺泡細胞凋亡與Bax表達的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SD大鼠30只(南華大學動物實驗中心)，雌雄不拘，體重(280±20)g，購回后適應性喂養1周。抽簽法隨機分為假手術組(A組)，急性水腫性胰腺炎組(B組)，急性出血壞死性胰腺炎組(C組)，每組10只。

1.2 實驗試劑與器材 牛磺膽酸鈉(北京豐特斯化工材料有限公司)；淀粉酶測試盒(南京建成生物工程研究所)；DNA原位末端標記凋亡檢測試劑盒，Bax兔抗大鼠多克隆抗體(武漢博士德生物技術有限公司)；微量泵(OLYMPUS公司)；創面封閉膠(廣州香雪生物醫學工程有限公司)。

1.3 動物模型制備 對逆行胰膽管穿刺注射法加以改進[1]：術前大鼠禁食12 h，自由飲水。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。麻醉滿意后固定于手術臺，術野備皮，絡合碘消毒，鋪無菌孔巾。取上腹部正中切口進腹。顯露、提取十二指腸，辨認胰膽管及肝門部膽總管。順胰膽管走行觀察乳頭開口位置，在其開口略偏下的系膜緣腸壁上選取一無血管區，用5號注射器針頭戳一小孔，置入預先處理過的硬膜外導管(直徑0.8 mm)。導管前端貼系膜緣腸壁向乳頭開口方向緩慢滑行，探入胰膽管內。將導管推進5 mm后，于胰膽管末端外放置一木質短棒(無菌棉簽棒自制)，用小圓針、1號線將胰膽管下段及其內的硬膜外導管一并縫合，確認導管通暢后，打結于木棒上，同法縫扎關閉肝門部膽總管。導管末端接輸液轉換器，用微量泵逆行泵入0.5%(B組)或5%(C組)的牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g，0.2 ml/min)。藥物泵入5 min后即可見胰膽管、主胰管擴張，胰腺組織水腫、充血(見圖1)，C組改變較B組嚴重。維持10 min后剪線，移除木棒，退出導管，用創面封閉膠封閉穿刺孔。將十二指腸復位，分層關腹。A組進腹后，僅翻動十二指腸、胰腺，不穿刺注藥。三組大鼠關腹后均于大腿外側皮下補液(生理鹽水2 ml/100 g)，蘇醒后禁食，自由飲水。

1.4 標本采集與觀測指標 術后12 h再次剖腹。肉眼觀察胰腺大體病理改變，根據Hughes標準[2]進行評分。觀察腹水顏色，收集腹水并計量。抽取下腔靜脈血檢測血清淀粉酶活性。采血后切取胰腺組織，10%福爾馬林固定，制作石蠟標本切片觀察。標本采集后斷頸法處死大鼠。

圖1 注藥后5 min，胰膽管擴張，胰腺水腫、充血

圖2 B組術后12 h胰腺輪廓較清楚，廣泛水腫，局部可見皂化斑

圖3 C組術后12 h胰腺輪廓消失，出血壞死嚴重，可見暗黑色壞死灶

圖4 C組術后12 h腸系膜處可見大量皂化斑

圖5 B組TUNEL法染色見大量腺泡細胞凋亡(400倍)

圖6 C組TUNEL法染色見少量腺泡細胞凋亡(400倍)

圖7 B組免疫組化染色Bax重度陽性(400倍)

圖8 C組免疫組化染色Bax輕度陽性(400倍)

1.4.1 HE染色與鏡下病理評分 切片后行HE染色，100倍鏡下觀察，根據Schmidt標準[3]評分。

1.4.2 DNA原位末端標記法(TUNEL法) 按試劑盒說明操作，腺泡細胞胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細胞。每張切片在400倍鏡下隨機選取5個視野，計算凋亡細胞數和總細胞數，凋亡指數(AI)＝凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.4.3 免疫組化SABC法 按試劑盒說明操作，Bax染色的陽性反應為腺泡細胞的胞膜、胞漿中出現棕黃色顆粒。每張切片在400倍鏡下隨機選取5個視野，根據陽性細胞數占視野中總細胞數的比例不同分為4級：陰性：陽性細胞數<10%;輕度陽性：陽性細胞數11%～25%;中度陽性：陽性細胞數26%～50%;重度陽性：陽性細胞數>50%。

1.5 統計學處理 使用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以()表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；等級資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗；相關性分析采用直線相關分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清淀粉酶活性與腹水量見表1。

表1 三組大鼠術后12 h各觀測指標比較

2.2 大體病理改變及評分 A組：胰腺正常，腹腔內無腹水與皂化斑。B組：胰腺輪廓較清楚，廣泛水腫，偶見點狀出血，未見明顯壞死，腹腔內有少、中量清亮腹水，可見點狀皂化斑(見圖2)。C組：胰腺輪廓消失，出血壞死嚴重，可見暗黑色壞死灶，腹腔內有大量血性腹水，胰腺、胰周及腸系膜等處可見大量皂化斑(見圖3、圖4)。大體病理評分見表1，病變愈重，分值愈高。

2.3 鏡下病理改變及評分 A組：除部分腺泡細胞水腫外，基本正常。B組：腺泡細胞水腫明顯，無壞死，有炎癥細胞浸潤，間質水腫，小葉間可見炎性滲出，葉間隙略增寬，偶見微血管破裂伴紅細胞溢出。C組：腺泡細胞腫脹明顯，呈片狀壞死，伴大量炎癥細胞浸潤，小葉結構紊亂，其間充斥著大量炎性滲出，葉間隙明顯增寬，間質內微血管破裂，大量紅細胞溢出。鏡下病理評分見表1，病變愈重，分值愈高。

2.4 腺泡細胞凋亡情況與AI見表1，圖5、圖6。

2.5 腺泡細胞Bax的表達情況見表1，圖7、圖8。

2.6 腺泡細胞凋亡與胰腺病變嚴重程度的相關性分析 直線相關分析顯示：B、C組中腺泡細胞AI與大體病理評分(B組：r=-0.761，P<0.05；C 組：r=-0.780，P<0.05)及鏡下病理評分 (B組：r=-0.763，P<0.05；C 組：r=-0.664，P<0.05)均呈顯著負相關。

3 討論

臨床上大多數AP患者病因明確(膽石或酒精因素)，但相同的致病因素作用于不同個體時，胰腺病變的嚴重程度以及臨床表現和預后卻不盡相同隨著分子生物學技術的發展，人們從細胞水平對AP進行了詳盡的研究[4-7]，結果表明，AP發生時，最早的病理變化出現在胰腺的腺泡細胞內，腺泡細胞本身對損傷的反應，即細胞的死亡方式(壞死或凋亡)，是決定病變嚴重程度以及后續病理過程發生、發展的關鍵。如果腺泡細胞以壞死的方式死亡，將伴隨劇烈的炎癥反應，易產生瀑布樣級聯效應，使病情兇險，并向重型發展；但若以凋亡的方式死亡，則伴隨的炎癥反應輕微，病情向輕型發展。

筆者成功建立了大鼠急性水腫性與出血壞死性胰腺炎模型，發現B、C組在血清淀粉酶活性、腹水量、大體以及鏡下病理評分等方面均存在顯著性差異。采用TUNEL法檢測腺泡細胞的凋亡情況發現，B組AI顯著高于C組，直線相關分析發現，兩組AI與大體及鏡下病理評分等反映胰腺病變嚴重程度的指標均呈顯著負相關關系，AI高者，胰腺病變較輕，反之則較重。因此筆者認為，AP時腺泡細胞的凋亡是機體的一種自我保護機制。

Bax作為Bcl-2家族成員之一[8]，主要通過改變線粒體外膜的通透性，調節促凋亡因子的釋放來調控細胞的凋亡[9]。通過實驗發現，C組Bax的陽性率顯著低于B組，兩組間Bax的表達以及腺泡細胞AI均存在顯著差異。據此推測，兩組大鼠在血清淀粉酶活性、腹水量、大體及鏡下病理評分之間的區別可能是由于組間Bax的差異性表達導致腺泡細胞的凋亡不等所致，提示Bax參與了AP時腺泡細胞凋亡的調控。

[1]謝榮俊，張樹友，費書珂，等.大鼠重癥急性胰腺炎模型制備方法的探討與改進[J].中國醫藥導報，2007，11(04Z)：22-24.

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[3]Schmidt J，Rattner D W，Lewandrowski K，et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J].Ann Surg，1992，215(1)：44-56.

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[6]Bhatia M.Apoptosis of pancreatic acinar cells in acute pancreatitis：is it good or bad[J].J Cell Mol Med，2004，8(3)：402-409.

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[9]范志寧，劉訓良.細胞凋亡與急性胰腺炎關系的研究進展[J].胰腺病學，2006，6(3)：184-186.