溫針灸對嗎啡戒斷大鼠NR2B受體表達影響的研究*

衛 哲，董 哲，孫遠征，尚 穎

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱150001;2.哈爾濱市兒童醫院，黑龍江哈爾濱150010)

目前，嗎啡依賴和戒斷的機制已成為國內外眾多學者研究的熱點和難點。藥物反復濫用會影響機體學習記憶能力，NR2B作為NMDA受體的主要亞基之一，其高表達的轉基因小鼠具有超常的學習記憶能力，在行為學測試中表現出良好的學習記憶能力，有學者認為NR2B與大腦的認知密切相關，從而將NR2B命名為“聰明基因”[1]。而NR2B蛋白在嗎啡和自然獎賞條件位置偏愛的學習中亦發揮著重要作用[2]。研究表明，藥物成癮的慢性過程可以導致腦功能的長時程變化，引起中樞突觸可塑性的變化，多種學習記憶系統參與其中，多巴胺、谷氨酸等相對獨立又互相關聯的神經遞質系統共同參與成癮行為的學習記憶調控過程，對記憶產生正向或反向的影響，調節著記憶的鞏固。本研究通過溫針灸對NR2B受體表達的影響，從而分析嗎啡戒斷后大鼠的空間學習能力的中樞作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

選擇由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供的雄性SD大鼠40只，體重為(190±30)g。實驗前進行適應性喂養1周，房間溫度、濕度分別在 22℃、75%左右。

1.2 實驗試劑

兔抗多克隆一抗(武漢博士德生物工程有限公司);二抗PV6001(北京中山生物工程有限公司);鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠)。

1.3 主要儀器與設備

MT－200Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統、KWD808Ⅱ脈沖治療儀、moticam3000顯微攝影成像系統等。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

采用transform隨機分組方法，將40只大鼠分為對照組、模型組、手針組、溫針灸組，每組各10只。

2.2 造模方法

對模型組、手針組、溫針灸組大鼠均采用逐日遞增法背部皮下注射鹽酸嗎啡注射液，5天的劑量分別為(20 mg/kg，30 mg/kg，40 mg/kg，50 mg/kg，50 mg/kg)，2次/天(8 am，4 pm)。對照組以相同劑量、相同時間注射生理鹽水。嗎啡末次注射后3 h給予納絡酮腹腔注射(3 mg/kg)快速戒斷，隨即將大鼠置于3000 ml燒杯中，觀察10 min內大鼠的跳躍、舔陰、豎立、濕抖、洗臉等戒斷反應，建立嗎啡依賴戒斷大鼠模型[3～4]。評分標準見表 1。

表1 戒斷癥狀評分標準

2.3 各組處理

對照組:第6天開始同溫針灸組以相同方法固定。

模型組:按上述方法造模，第6天開始同溫針灸組以相同方法固定。

溫針灸組:第6天開始予溫針灸治療，取百會、雙側腎俞，針刺得氣后，在針尾上搓捏少許艾絨點燃施灸，只待燃盡，除去灰燼，留針稍許再將針拔出，共計留針15 min，連續6天。

手針組:第6天開始予針刺治療，選穴方法同溫針灸組，15次/min，1次/天，連續6天。

2.4 灌注取材

治療結束后各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，麻醉后開胸，于右心房和左心室心尖部各做一切口，進行主動脈插管快速灌注沖洗液 200 ～250 ml[5]，開顱，完整取出全腦組織，分離Nac腦區，液氮保存。

2.5 免疫組化PV二步法

①切片常規脫蠟到水; ②3% H2O2中孵育10 min，PBS 沖洗2 min3 次; ③微波修復; ④滴加一抗，4℃冰箱中過夜，PBS 沖洗2 min3 次; ⑤滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS 沖洗2 min3 次; ⑥DAB 顯色5 ～ 10 min，蒸餾水充分沖洗; ⑦蘇木素復染1 min; ⑧常規脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.6 結果觀察方法

moticam3000顯微攝影成像系統于400倍視野下攝影，每組隨機選取10個視野，用Motic image 3.2圖像分析軟件進行分析，計算平均光密度。陽性表達呈黃色或棕黃色。

2.7 統計學處理

由SPSS16.0統計軟件包進行數據處理。以P＜0.05為有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 嗎啡戒斷大鼠行為學觀察

大鼠戒斷癥狀評分，見表2。表2結果顯示，除對照組外，模型組、溫針灸組、手針組大鼠經快速戒斷后出現站立、激惹、齒顫等一系列戒斷癥狀，戒斷癥狀的評分值明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，說明動物模型建立成功。

表2 嗎啡戒斷大鼠癥狀觀察(±s)

表2 嗎啡戒斷大鼠癥狀觀察(±s)

注:與對照組相比，△P ＜0.05。

0.3 ±0.48模型組 20.5 ±4.16△溫針灸組 18.5 ±3.78△手針組 21.41 ±5.59組別 戒斷癥狀評分值對照組△

3.2 Morris水迷宮測試結果

嗎啡戒斷后大鼠的MWM迷宮測試結果，見表3。表3結果顯示，與模型組比較，溫針灸組、手針組的平均潛伏期明顯縮短，有非常顯著性統計學差異(P＜0.01)，提示其空間學習能力明顯改善;與手針組比較，溫針灸組的平均潛伏期明顯縮短，有顯著性統計學差異(P＜0.05)，提示溫針灸組在改善戒斷大鼠空間學習能力方面優于手針組。

表3 嗎啡戒斷后不同組別大鼠MWM迷宮測試(±s)

表3 嗎啡戒斷后不同組別大鼠MWM迷宮測試(±s)

注:與對照組比較，▲P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.01;與溫針灸組比較，●P ＜0.05。

組別 例數(只)平均潛伏期(s)第3天 第4天 第5天對照組 10 12.50 ±3.38☆ 11.12±2.80☆ 8.87 ±3.48☆模型組 10 50.12 ±6.79▲ 46.00 ±4.53▲ 43.25 ±6.52溫針灸組 10 27.2 ±10.18▲☆ 25.84 ±11.21▲☆ 24.5 ±9.72▲☆手針組 10 32.7 ±11.23▲☆● 29.37 ±10.76▲☆● 7.02 ±9.96▲☆●

3.3 NMDA－NR2B受體表達的變化

不同的方法治療6天后，嗎啡戒斷大鼠NAc腦區NMDA－NR2B受體在神經元細胞質中陽性表達(陽性染色細胞的平均光密度)，見表4所示。

表4 各組大鼠腦區NMDA－NR2B受體表達的影響(±s)

表4 各組大鼠腦區NMDA－NR2B受體表達的影響(±s)

注:與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與對照組比較，◆P ＜0.05，◆◆P ＜0.01。

NAc對照組 10 0.142 ±0.01組別 n△△模型組 10 0.104 ±0.01◆◆溫針灸組 10 0.135 ±0.01△△◆手針組 10 0.128 ±0.001△△◆

表4結果顯示，與對照組比較，模型組、溫針灸組、手針組NAc腦區的NMDA－NR2B受體表達有顯著性差異(P＜0.01)，表明嗎啡戒斷后大鼠NAc腦區NMDA－NR2B受體表達降低。與對照組比較，溫針灸組大鼠NAc腦區的NMDA－NR2B受體表達有顯著性差異(P＜0.05)。與模型組比較，溫針灸組、手針組NAc腦區的NMDA－NR2B受體表達有非常顯著性差異(P＜0.01)，表明針刺可以增高嗎啡成癮戒斷后大鼠NAc腦區NMDA－NR2B受體表達，推測與改善戒斷后大鼠的學習記憶能力有關。

4 討論

本實驗以逐日遞增法、快速戒斷法建立嗎啡依賴戒斷SD大鼠模型，實驗結果顯示，溫針灸可以明顯縮短大鼠Morris水迷宮平均潛伏期(P＜0.01)，調整大鼠NAc腦區的NMDA－NR2B受體表達(P＜0.01)，認為其可以改善嗎啡戒斷大鼠空間學習能力。

Morris水迷宮(Moms Water Maze，MWM)是目前國際通用的空間辨別學習記憶模型，用來評定大鼠的空間學習能力。其操作簡單，數據可靠，在精神科及神經科領域得到了比較廣泛的應用。目前，檢測大鼠記憶力的Morris水迷宮的指標有很多，包括有定位航行實驗、空間探索實驗等等，其中最常用的評價指標是定位航行實驗中的指標——“逃避潛伏期”[6]。在定位航行實驗中多次訓練大鼠尋找站臺可以提高大鼠的空間學習能力[7]。羅小泉等[8]研究發現，不同的入水象限，不同的入水次序對Morris水迷宮的檢測大鼠記憶力都有影響。

溫針灸是針刺與艾灸結合使用的一種方法，具有溫通經脈、行氣活血的作用。中醫學認為，阿片類物質成癮后戒斷綜合征主要以肝、脾、腎三臟陰液不足、陰虛火旺為根本病機改變[5]。溫針灸能夠以溫熱效應促使機體氣血周身流動，滋陰溫陽，促進機體陰陽平衡，使戒斷癥狀得到抑制，從而起到戒斷毒癮的作用。目前，對于嗎啡成癮后戒斷綜合征多側重于電針、艾灸單一穴位的實驗研究，很少有關于溫針灸對于嗎啡成癮戒斷后癥狀作用的研究。

本研究鑒于中腦邊緣多巴胺系統在藥物依賴形成中所起的重要作用，并基于大腦內NAc多巴胺系統為藥物成癮的神經生物學基礎以及藥物戒斷后腦內Glu受體表達的改變，從NR2B受體角度分析溫針灸對嗎啡成癮戒斷后空間學習能力的影響機制，為針灸治療嗎啡成癮戒斷癥狀的臨床推廣提供新的理論依據。對于針灸戒毒的研究還應加強針灸手法、穴位配伍、針灸時機等不同影響因素的技術研究，進而評價針灸戒毒的效果，以便更好的指導臨床。

[1]Bi H，Sze Cl.N－methyl－D －aspartate receptor subunit NR2A and NR2B messenger RNA levels are altered in the hippocampus and entorhinal cortex in Alzheimer’s disease[J].J Neuorl Sci，2002，200:11－18

[2]MaYY，Guo CY，Yu P，et al.The role of NR2B containing NMDA receptor in Place Preference conditioned with morphine and natural reinforcers in rats[J].ExP Neurol，2006，200(2):343 － 355

[3]何學令，尹海林，王雪，等.大鼠嗎啡依賴模型的建立[J].四川動物，2005，24(4):526，626

[4]胡華，余會平，蒙華慶，等.嗎啡依賴大鼠腦超微結構及其Bcl－2表達研究[J].現代預防醫學，2010，37(16):3114 －3117

[5]孫遠征，衛哲，馬俊，王明明.熒光定量PCR法檢測電針對嗎啡戒斷后大鼠腦組織CREBmRNA表達的影響[J].醫學信息，2011，24(1):271－272

[6]陳羅西，郭玲玲，李亮.Morris圓形水迷宮的應用及其相關檢測指標分析[J].遼寧中醫藥大學學報，2008，10(8):55

[7]鄭紅，王文，劉渝，等.重復Morris水迷宮訓練提高大鼠空間學習能力卻不影響空間記憶能力[J].神解剖學雜志，2007，23(6):599

[8]羅小泉，駱利平，陳海芳，等.Morris水迷宮檢測大鼠記憶力方法的探討[J].時珍國醫國藥，2010，21(10):2667 －2669