二氯化鈷致人結腸癌細胞系CacyBP/SIP核轉位

謝福利，仇長青，趙盈盈，楊 博，馮珊珊，翟惠虹*

(1.寧夏師范學院醫學院，寧夏固原756000;2.寧夏醫科大學臨床學院總醫院消化內科，寧夏銀川750004)

低氧在結腸癌發生過程中具有重要的作用［1］，可促進結腸癌細胞增殖、抑制凋亡及增強化療耐藥［2］，但具體機制不清。CacyBP/SIP自1996年發現以來，越來越多的證據顯示［3］:在腫瘤發生、發展、侵襲及轉移等方面都有重要的作用;同時，具有依賴Ca2+濃度的核轉位現象［4］，核轉位后促進結腸癌細胞增殖［5］。低氧是否可誘導CacyBP/SIP核轉位?本研究擬通過構建CacyBP/SIP過表達慢病毒顆粒，轉染至結腸癌細胞，給予 CoCl2刺激，觀察CacyBP/SIP在結腸癌細胞中的定位。

1 材料與方法

1.1 材料

結腸癌細胞SW480(上海中科院);CoCl2(Sigma公司);胞質胞核蛋白抽提試劑盒(Pierce公司);CacyBP/SIP mAb(Cell signaling公司);293T細胞、pGC-LV重組載體、pHelper 1.0和pHelper 2.0(吉凱基因公司);其他相關試劑(Fermentas、SinoBio、Takara、NEB、捷瑞公司)。

1.2 方法

1.2.1 過表達CacyBP/SIP慢病毒載體構建:應用人結腸癌細胞系HCT-116的cDNA序列，采用Primer Premier v5.0軟件設計上游和下游引物，用PCR法擴增CacyBP/SIPcDNA序列。帶有綠色熒光的慢病毒載體與目的基因分別用NheⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，T4連接酶將酶切后的產物相連，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，應用PCR法篩選陽性克隆，接種陽性轉化子，送測序。用 Lipofectamine2000共轉染pGC-LV載體和兩種輔助包裝原件載體至293T細胞包裝。培養8h更換為完全培養基，培養48 h后，收集上清液，濃縮后在293T細胞中采用逐孔稀釋法測定并標定病毒滴度。

1.2.2 轉染結腸癌細胞:常規培養傳代，在T50瓶細胞長至30% ～50%時，每瓶加入500 μL(5 mg/L)Polybrene、4 400 μL完全培養基和100 μL(1 ×108個細胞)過表達CacyBP/SIP的慢病毒顆粒，放入培養箱培養8～12 h棄去細胞上清，更換為新鮮培養基繼續培養?！?br>