益生菌對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜 TLR2、TLR4表達(dá)及 NF-κB活性的影響

曹艷菊

解放軍第306醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100101

益生菌對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜 TLR2、TLR4表達(dá)及 NF-κB活性的影響

曹艷菊

解放軍第306醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100101

目的 通過檢測益生菌對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞(IECs)Toll樣受體(Toll Like recefor，TLR)、TLR4表達(dá)及腸黏膜核因子，kappa B活化的影響，探討益生菌預(yù)防與輔助治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。方法 將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，即正常對照組(N)、模型組(M)、益生菌組(P)。正常對照組正常飼養(yǎng)，不予任何處理;模型組給予含5% 葡聚糖硫酸鈉 dextran sulfate sodium的飲用水10 d建立亞急性結(jié)腸炎模型，第11 d開始常規(guī)飼養(yǎng)觀察2周;益生菌組則在建立模型后給予雙歧三聯(lián)活菌500 mg·kg－1·d－1灌胃，1次/d，共2周;2周后處死所有大鼠，觀察疾病活動指數(shù) (DAI)，進(jìn)行組織學(xué)評分 (HPS)和分離ICEs并提取ICE中的總RNA，用RT-PCR法檢測TLR2、TLR4的表達(dá);采用免疫組織化學(xué)方法檢測NF-κB的活性情況。結(jié)果 益生菌組的癥狀、組織損害程度均較模型組明顯減輕;模型組和益生菌組TLR2和TLR4的表達(dá)均明顯高于正常對照組(P＜0.001);與模型組比較，益生菌組TLR2的表達(dá)增加(P＜0.05)，而TLR4的表達(dá)則明顯下降(P＜0.001);模型組NF-κB活性明顯高于益生菌組和正常對照組(P＜0.001)，益生菌組與正常對照組NF-κB活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 益生菌通過促使TLR2表達(dá)進(jìn)一步增加，并可抑制TLR4的表達(dá)，進(jìn)而控制NF-κB的活性，并在緩解腸道炎癥中發(fā)揮作用。

益生菌;葡聚糖硫酸鈉;結(jié)腸炎;Toll樣受體;核因子kappa B(NF-κB)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，目前認(rèn)為是基因易感性、腸道細(xì)菌及自身免疫反應(yīng)協(xié)同作用的結(jié)果［1］。近年來，隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，UC在我國的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。當(dāng)前治療仍以5-氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等為主，這些治療有不良反應(yīng)嚴(yán)重、停藥后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。益生菌是臨床廣泛應(yīng)用的一類微生態(tài)制劑，研究［2-3］表明益生菌對UC具有緩解作用，而且對UC復(fù)發(fā)有一定預(yù)防作用，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠模型，觀察益生菌對DSS結(jié)腸炎的療效及對病變腸黏膜上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IECs)中 Toll樣受體(toll like receptor，TLR)TLR2、TLR4 表達(dá)及黏膜中NF-κB活性的影響，旨在探討益生菌治療UC的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 10～12周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±10)g(購自北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心)，隨機(jī)分為正常對照組、模型組和益生菌組，每組10只，飼養(yǎng)于恒溫、恒濕清潔級動物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS)，分子量5 KD，購自Sigma公司;RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司;NF-κB檢測所需一抗及二抗購自Santa Cruz公司;益生菌:雙歧三聯(lián)活菌(含雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌，活菌量＞5.0×107CFU/210 mg)，上海醫(yī)藥有限公司信宜制藥總廠。

1.3 UC動物模型的建立及處理 造模前大鼠在清潔級動物房飼養(yǎng)1周，之后模型組及益生菌治療組大鼠按照Cooper等［4-5］經(jīng)典方法，給予含5%DSS飲用水10 d建立亞急性UC動物模型。第11 d開始模型組常規(guī)飼養(yǎng)觀察;益生菌組則給予雙歧三聯(lián)活菌500 mg·kg－1·d－1灌胃，1 次/d，共 2 周，此期間對照組和模型組給予等容量生理鹽水灌胃;正常對照組不予DSS及益生菌干預(yù)，僅同步常規(guī)飼養(yǎng)觀察。觀察各組大鼠的體質(zhì)量、大便性狀及便血情況。灌胃2周后將所有大鼠拉頸處死，分離全結(jié)腸，縱行剖開腸管，用冷生理鹽水沖洗展平，肉眼觀察結(jié)腸黏膜損傷程度，分別取遠(yuǎn)段、中段、近段結(jié)腸組織約0.5cm×0.5 cm各一塊，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察及免疫組化檢測NF-κB活化。剩余結(jié)腸組織用以檢測TLR2和TLR4的表達(dá)。

1.4 腸上皮細(xì)胞的提取 將取得的腸道組織翻轉(zhuǎn)，使腸內(nèi)膜向外，用冷D-Hanks液充分沖洗去除黏附在黏膜的糞便，將腸組織置于含5.0 mmol/L EDTA和145 μg/mL DTT的 D-Hanks液中 37℃搖床 90 min，以3 000 r/min離心15 min，取沉淀即為腸上皮細(xì)胞。

1.5 RT-PCR檢測上皮細(xì)胞(IECs)中的TLR2和TLR4 的表達(dá)［6-7］

1.5.1 RT-PCR方法:提取IECs的總RNA檢測TLR2和TLR4的表達(dá)。引物分別為:TLR2(FWD:ttgctcctgcgaactcctat，REV:gctttcttgggcttcctctt);TLR4(FWD:gctttcacctctgccttcac，REV:cgaggcttttccatccaata);NADPH(FWD:accacagtccatgccatcac，REV:tccaccaccctgttgctgta)。RT反應(yīng)體系:dNTP Mixture 1 μL;10 ×RT Buffer 1 μL;Rnase Free H2O 3.75 μL;RNase Inhibitor 0.25 μL;MgCl22 μL;AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL;oligo dT-Adaptor primer 0.5 μL;total RNA 1 μL。RT 反應(yīng)條件:42℃ 30 min;99℃ 5 min，5℃ 5 min，1個循環(huán)。PCR 反應(yīng)體系:PCR Reverse Prime 0.5 μL;PCR FWD Prime 0.5 μL;5 μ PCR Buffer 10 μL;DH2O 28.75 μL;Taq 0.25 μL。PCR 反應(yīng)條件:TLR2:預(yù)變性 94 ℃ 2 min，1個循環(huán)，再變性94℃ 30 s;退火52.8℃ 30 s;72℃延伸2 min，共30個循環(huán)，再72℃延伸5 min。TLR4除退火溫度為54.3℃外，其余條件與 TLR2相同。

1.5.2 電泳成像:反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀成像分析，將各組標(biāo)本TLR2與TLR4所得條帶的灰度值(平均光密度值×條帶面積)與相應(yīng)的NADPH條帶的灰度值相比，得出標(biāo)本mRNA的相對量。

1.6 活化的 NF-κB檢測 采用免疫組織化學(xué)方法［8］:應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的三步法(標(biāo)記的鏈酶親和素－生物素法，即LSAB法)進(jìn)行檢測。一抗為NF-κB p65亞基的特異性單克隆抗體;二抗為生物素標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體。NF-κB活化的評分標(biāo)準(zhǔn)［9］:取400×倍視野4個進(jìn)行評分，每個視野中 NF-κB陽性細(xì)胞百分比(0～1)%為0分，(2～5)%為1分，(6～10)%為2分，(11～25)%為3分。取其平均分。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0軟件。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組及益生菌組DSS灌胃后，平均3～5 d出現(xiàn)典型癥狀(活動及進(jìn)食量明顯減少、腹瀉、便血、體質(zhì)量下降等)。益生菌組在建模后經(jīng)2周雙歧三聯(lián)活菌灌胃治療，腹瀉、便血癥狀明顯好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量不再下降;模型組癥狀一直持續(xù)無減輕，體質(zhì)量繼續(xù)下降;正常對照組則無上述典型癥狀出現(xiàn)，而且體質(zhì)量逐漸增加。

2.2 組織病理學(xué)變化 模型組腸黏膜、黏膜下見大量炎性細(xì)胞浸潤，潰瘍邊緣腺體增生較重，結(jié)構(gòu)紊亂，隱窩膿腫形成，杯狀細(xì)胞減少，黏膜下層出血、水腫(見圖1)。益生菌治療組黏膜、黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，黏膜充血、水腫明顯減輕，潰瘍減少或消失(見圖2)。正常對照組腸上皮腺體排列整齊，腺體間有較多杯狀細(xì)胞，固有層少量淋巴細(xì)胞浸潤(見圖3)。

2.3 腸黏膜細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá) 模型組和益生菌組TLR2和TLR4的表達(dá)均明顯高于正常對照組(P＜0.001);與模型組比較，益生菌組TLR2的表達(dá)增加(P＜0.05)，而 TLR4的表達(dá)則明顯下降(P＜0.001，見表2)。

圖1 模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理情況HE染色(40×);圖2 益生菌組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理情況HE染色(40×);圖3 正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理情況HE染色(40×)Fig 1 The histopathology condition in model group HE染色(40×);Fig 2 The histopathology condition in probiotics group HE染色(40×);Fig 3 The histopathology condition in normal control groupHE染色(40×)

表2 各組腸黏膜細(xì)胞TLR2及TLR4的表達(dá)±s)Tab 2 The expression of TLR2 and TLR4 in IECs± s)

表2 各組腸黏膜細(xì)胞TLR2及TLR4的表達(dá)±s)Tab 2 The expression of TLR2 and TLR4 in IECs± s)

與益生菌組比較，*P ＜0.001，＊＊P ＜0.05

組別TLR2 TLR4正常對照組 0.23 ±0.06* 0.26 ±0.08*模型組 0.61±0.07＊＊ 0.96±0.06*益生菌組0.70 ±0.09 0.45 ±0.08

2.4 活化的NF-κB免疫組織化學(xué)染色及半定量分析

正常對照組僅偶見NF-κB活化細(xì)胞(陽性細(xì)胞)。模型組的NF-κB陽性細(xì)胞明顯增多，主要見于固有層中，高倍鏡下可見染色主要位于細(xì)胞核，呈棕褐色。相比之下，模型組NF-κB評分明顯高于益生菌組 (P＜0.001)和正常對照組 (P＜0.001);益生菌組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表3)。

表3 各組活化的NF-κB評分s)Tab 3 The activation score of NF-κB in colon mucosa± s)

表3 各組活化的NF-κB評分s)Tab 3 The activation score of NF-κB in colon mucosa± s)

與正常對照組及益生菌組比較，*P＜0.001;與正常對照組比較，＊＊P ＞0.05

組別 例數(shù) NF-κB 活化評分正常對照組10 0.46 ±0.52模型組 10 2.36 ±0.85*益生菌組 10 0.76 ±0.55＊＊

3 討論

近年來國內(nèi)外研究表明［10］，潰瘍性結(jié)腸炎與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，在活動性UC患者腸黏膜表面革蘭氏陽性的有益菌如雙歧桿菌和乳酸桿菌是缺失的，相反革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌、變形桿菌、擬桿菌在黏膜表面濃度增加。腸道菌群失調(diào)可能是UC的誘發(fā)因素及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。作者［11-13］之前對應(yīng)用抗生素導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)及結(jié)腸炎的研究發(fā)現(xiàn)，在抗生素應(yīng)用過程中，腸道的生理性菌群受到破壞，導(dǎo)致條件致病菌大量繁殖，并激發(fā)腸黏膜免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)腸炎，當(dāng)用抗生素治療同時補(bǔ)充益生菌，則明顯降低腸道菌群失調(diào)和結(jié)腸炎的發(fā)生，從正反兩方面證明了菌群紊亂與結(jié)腸炎關(guān)系密切。Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)家族是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要意義的先天性免疫跨膜受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，能夠特異性地識別病原微生物。革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)增加，并通過與TLR4的結(jié)合激活NF-κB信號傳導(dǎo)通路，引起前炎癥因子TNF-α、IL-1表達(dá)增加，后者再進(jìn)一步激活NF-κB，繼而誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，且不斷放大［7，14］。近年來研究［15-17］表明 UC 時結(jié)腸上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)大量增加，同時NF-κB呈過度激活狀態(tài)，且與病情活動性和嚴(yán)重性明顯相關(guān)。當(dāng)腸道菌群與宿主之間的平衡被打破，尤其是革蘭陰性細(xì)菌增加時，LPS誘導(dǎo)TLR4-NF-κB途徑激活，炎癥反應(yīng)不斷放大。因此，維持腸道微生態(tài)平衡，抑制或阻斷TLR4-NF-κB信號通路，將成為控制潰瘍性結(jié)腸炎病情及預(yù)防其復(fù)發(fā)的新靶向［18-19］。TLR2能夠識別革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、螺旋體及支原體等多種細(xì)菌的細(xì)胞壁成分，在多種微生物所致的急慢性感染中均具有重要作用［20］。益生菌多為革蘭陽性菌，可被TLR2特異性識別。目前關(guān)于TLR2在UC發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。正常情況下腸上皮細(xì)胞僅表達(dá)微量的TLR2和TLR4，腸道細(xì)菌通過TLRs短暫的激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對宿主起保護(hù)作用［19］。張素真等［7］應(yīng)用雙歧桿菌干預(yù)由DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的研究表明，雙歧桿菌可以誘導(dǎo)UC小鼠腸黏膜TLR2表達(dá)增加，同時抑制TLR4、IL-1及TNF-α的表達(dá)，而且黏膜炎癥明顯輕微。表明TLR2與雙歧桿菌結(jié)合通過某種機(jī)制抑制了TLR4-NF-κB信號通路，下調(diào)黏膜炎癥反應(yīng)。而馬原［6］的研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)性UC大鼠腸黏膜TLR2、TLR4的表達(dá)均明顯增加，雙歧桿菌干預(yù)后腸黏膜炎癥明顯減輕，且TLR2、TLR4的表達(dá)均明顯下調(diào)，TLR2的表達(dá)及其對益生菌干預(yù)反應(yīng)與張素真等的研究結(jié)果并不一致。本研究應(yīng)用雙歧三聯(lián)活菌干預(yù)由DSS誘導(dǎo)的UC大鼠，結(jié)果表明，結(jié)腸炎大鼠腸黏膜TLR2和TLR4的表達(dá)均明顯增加，益生菌干預(yù)后腸黏膜炎癥明顯減輕，TLR2表達(dá)進(jìn)一步增加，而TLR4的表達(dá)則明顯下調(diào)，與張素真的研究結(jié)果基本一致。而且從本研究設(shè)計可看出結(jié)腸炎本身即可導(dǎo)致TLR2的表達(dá)增加，原因可能由于TLR2特異性較差，既可識別革蘭陽性菌，也可識別革蘭陰性菌、真菌等多種細(xì)菌，導(dǎo)致菌群失調(diào)時TLR2和TLR4的表達(dá)均明顯增加。推測補(bǔ)充益生菌，則以激活TLR2的表達(dá)占優(yōu)勢，同時抑制了革蘭氏陰性菌及TLR4的表達(dá)，進(jìn)而使NF-κB活化受到抑制，炎癥得到控制。我們檢測的腸黏膜NF-κB活化結(jié)果也顯示NF-κB活性降低。推測雙歧三聯(lián)活菌通過上調(diào)腸黏膜細(xì)胞TLR2的表達(dá)，進(jìn)而抑制TLR4-NF-κB通路，從而在緩解腸道炎癥中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究表明，實(shí)驗(yàn)性UC大鼠腸黏膜TLR2、TLR4高表達(dá)，并且NF-κB處于激活狀態(tài)，益生菌干預(yù)可增加TLR2的表達(dá)、抑制TLR4表達(dá)及NF-κB活化，推測益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎腸道炎癥的緩解作用是通過上調(diào)TLR2表達(dá)、抑制TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)途徑完成的。

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The effects of probiotics on expression of TLR2，TLR4 and activation of NF-κB in rats with DSS-induced colitis

CAO Yanju
Department of Gastroenterology，306 Hospital of Chinese PLA，Beijing 100101，China

ObjectiveTo detect the expression of TLR2，TLR4 and activation of NF-κB in colon mucosa in rats with DSS-induced colitis，and to investigate the mechanism of probiotics in ulcertive colitis.MethodsThirty male SD rats were divided randomly into three groups:normal control group(N)，model group(M)and probiotics group(P).Subacute colitis was induced with 5%DSS in drinking water for 10 d in group M and group P.After DSS exposure，the rats in group P were subjected to oral administration of bifido-bacterium solution(500 mg·kg－1·d－1)for 2 weeks.In group M and group N，oral saline was administered.Disease activity index(DAI)and histopathological score(HPS)were observed.The expression of TLR2 and TLR4 in IECs were tested by RT-PCR.The activation of NF-κB in colon mucosa was further studied by immuno-histochemistry.ResultsDAI and HPS in group P were significant lower than those in group M.The expression of TLR2 and TLR4 in group M and P were increased markedly(P＜0.001).Compared with the group M，expression of TLR2 was increased(P ＜0.05)and expression of TLR4 was decreased(P ＜0.001)in group P.The activation of NF-κB in group M was increased significantly than those in group P and group N(P ＜0.001).There was no difference in the activation of NF-κB between group N and group P(P ＞0.05).ConclusionThe bifidobacterium(probiotics)may exert their effects in DSS induced UC by the expression of TLR2，then inhibit the expression of TLR4 and the activation of NF-κB.

Probiotic;Dextran sulfate sodium(DSS);Ulcerative colitis;Toll like receptor(TLR);Nuclear factor kappa B(NF-κB)

R574.62

A

1006－5709(2012)08－0760－04

2012-04-18

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.022