胃黏膜病變演化過(guò)程中抗氧化蛋白Peroxiredoxin 6的表達(dá)及其與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

郭紅偉，朱婭麗，張秀茹，楊桂彬

北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院航天中心醫(yī)院1.消化內(nèi)科;2.綜合內(nèi)科;3.病理科，北京 100049

論著·幽門螺桿菌

胃黏膜病變演化過(guò)程中抗氧化蛋白Peroxiredoxin 6的表達(dá)及其與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

郭紅偉1，朱婭麗2，張秀茹3，楊桂彬1

北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院航天中心醫(yī)院1.消化內(nèi)科;2.綜合內(nèi)科;3.病理科，北京 100049

目的 探討胃黏膜病變演化過(guò)程中抗氧化蛋白Peroxiredoxin 6(Prx6)表達(dá)水平變化及其與幽門螺桿菌(H.pylori)感染的關(guān)系。方法 根據(jù)組織形態(tài)學(xué)將104例臨床內(nèi)鏡檢查活檢標(biāo)本分為慢性淺表性胃炎(33例)、慢性萎縮性胃炎(25例)、腸上皮化生(32例)及異型增生(14例)4組。用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)組織標(biāo)本中Prx6的表達(dá)水平。用快速尿素酶試驗(yàn)及Warthin-Starry銀染檢測(cè)H.pylori感染。結(jié)果 Prx6在慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為39.4%(13/33)、80.0%(20/25)、93.8%(30/32)、92.9%(13/14)，過(guò)表達(dá)率分別為 15.2%(5/33)、44.0%(11/25)、81.3%(26/32)、85.7%(12/14)。慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎組H.pylori陽(yáng)性者Prx6陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于H.pylori陰性者(P＜0.05)，腸上皮化生組Prx6的表達(dá)在H.pylori陽(yáng)性者和陰性者無(wú)顯著差異(P＞0.05)。結(jié)論 在胃黏膜病變演化過(guò)程中，Prx6的表達(dá)隨著胃黏膜病變的進(jìn)展而增加，H.pylori在胃黏膜病變演化的早期階段促進(jìn)了Prx6的表達(dá)。

胃黏膜病變;幽門螺桿菌;Peroxiredoxin 6

腸型胃癌是幽門螺桿菌(H.pylori)相關(guān)的慢性胃 黏膜疾病演化過(guò)程的最后階段，其發(fā)生是一個(gè)從正常胃黏膜→慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→非典型增生→原位癌→浸潤(rùn)癌多階段形態(tài)學(xué)異常的改變過(guò)程［1-2］。H.pylori通過(guò)多種機(jī)制參與并促進(jìn)胃黏膜病變演化過(guò)程［3］，其中H.pylori引起的氧化應(yīng)激在胃癌發(fā)生中的作用引起越來(lái)越多的關(guān)注。Per-oxiredoxin 6(Prx6)是抗氧化蛋白Peroxiredoxins家族中的一員，參與乳腺癌［4］、膀胱癌［5］、食管鱗癌［6］等多種腫瘤的發(fā)生，其在胃黏膜病變演化中的作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究通過(guò)在胃黏膜活檢標(biāo)本中檢測(cè)H.pylori感染及Prx6蛋白表達(dá)，從氧化－抗氧化平衡角度探討H.pylori感染在胃黏膜病變演化中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 104例內(nèi)鏡檢查標(biāo)本均來(lái)自航天中心醫(yī)院病理科，患者因上胃腸道癥狀在航天中心醫(yī)院消化科就診并接受內(nèi)鏡檢查，男61例，平均年齡(56.3±11.7)歲，女 43 例，平均年齡(60.7 ±15.1)歲。經(jīng)內(nèi)鏡檢查及病理證實(shí)為慢性淺表性胃炎33例、慢性萎縮性胃炎25例、腸上皮化生32例、異型增生14例。每例均在胃竇部取材，標(biāo)本經(jīng)中性甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行病理組織檢查。

1.2 H.pylori感染的確定 所有患者在內(nèi)鏡檢查時(shí)，胃竇活檢兩塊分別行快速尿素酶試驗(yàn)(RUT)及組織學(xué)檢查檢測(cè)H.pylori感染，RUT試劑由福建三強(qiáng)生物化工有限公司提供，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。H.pylori檢測(cè)采用Warthin-Starry銀染方法。兩項(xiàng)檢測(cè)均陽(yáng)性確診為H.pylori陽(yáng)性，兩項(xiàng)均陰性確診為 H.pylori陰性。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 采用PowerVisionTM二步法，將切片抗原修復(fù)后加入稀釋度1∶1 000兔抗人多克隆Prx6抗體，濕盒孵育，4℃過(guò)夜;以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。二抗采用HRP標(biāo)記羊抗兔多聚體，DAB顯色，顯微鏡下控制時(shí)間，充分沖洗中止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封固。結(jié)果判定采用雙盲法，分別在低倍視野(40×)觀察，在高倍視野(200×)確認(rèn)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度確定染色結(jié)果:細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)呈淡棕色為弱陽(yáng)性(+)，棕色者為陽(yáng)性(++)，深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。以同一切片同類病變細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)超過(guò)30%為陽(yáng)性病例，以陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性作為過(guò)表達(dá)病例［7］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同胃黏膜病變中Prx6的表達(dá) Prx6陽(yáng)性染色主要集中于細(xì)胞質(zhì)(見(jiàn)圖1)。Prx6在慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為39.4%(13/33)、80.0%(20/25)、93.8%(30/32)、92.9%(13/14)，過(guò)表達(dá)率分別為 15.2%(5/33)、44.0%(11/25)、81.3%(26/32)、85.7%(12/14)。與慢性淺表性胃炎相比，Prx6在慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生胃黏膜中的表達(dá)均明顯升高(見(jiàn)表1)。

表1 不同程度胃黏膜病變中Prx6的表達(dá)Tab 1 Prx6 protein expression in gastric mucosal lesions

2.2 H.pylori感染與胃黏膜組織中Prx6表達(dá)的關(guān)系

Prx6在H.pylori陽(yáng)性胃黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為91.2%(62/68)，在 H.pylori陰性組織中表達(dá)率為38.9%(14/36)。H.pylori陽(yáng)性胃黏膜組織中 Prx6表達(dá)率顯著高于 H.pylori陰性的胃黏膜組織(P＜0.01)，且Prx6的著色較 H.pylori陰性胃黏膜著色深(見(jiàn)圖1)。Prx6在H.pylori陽(yáng)性的慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎組織中的表達(dá)顯著高于H.pylori陰性者(P＜0.05)。在腸上皮化生和異型增生組織中，這種差異并不明顯(見(jiàn)表2)。

表2 H.pylori感染與胃黏膜組織中Prx6表達(dá)的關(guān)系Tab 2 The relationship between H.pylori infection and Prx6 expression in gastric mucosal lesions

圖1 Prx6在 H.pylori陽(yáng)性及H.pylori陰性胃黏膜組織中的表達(dá)(200×)A、B、C、D 為H.pylori陰性組織;E、F、G、H 為 H.pylori陽(yáng)性組織，其中:A、E慢性淺表性胃炎;B、F慢性萎縮性胃炎;C、G腸上皮化生;D、H異型增生Fig 1 Prx6 expression in gastric mucosal lesions with different H.pylori status(200×)A，B，C，D:gastric mucosal lesions without H.pylori infection;E，F(xiàn)，G，H:gastric mucosal lesions with H.pylori infection;A，E:Chronic superficial gastritis;B，F(xiàn):Chronic atrophic gastritis;C，G:Intestinal metaplasia;D，H:Dysplasia tissues

3 討論

H.pylori為胃癌的I類生物學(xué)致癌因子，通過(guò)多種機(jī)制參與并促進(jìn)胃黏膜病變演化過(guò)程，其中H.pylori感染所致氧化應(yīng)激在胃癌發(fā)生中的作用引起越來(lái)越多的關(guān)注。有研究表明，H.pylori感染菌可明顯增加胃黏膜內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，并通過(guò)其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷胃黏膜。Kim［8］研究發(fā)現(xiàn)ROS含量增加會(huì)引起炎癥因子的過(guò)表達(dá)，破壞細(xì)胞增殖凋亡平衡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這一過(guò)程與H.pylori感染有一定相關(guān)性。Farinati等［9］的研究表明H.pylori誘導(dǎo)的氧化性DNA損傷可出現(xiàn)在非萎縮性胃炎→萎縮性胃炎→腸化生→異型增生→胃癌這一癌變模式的各個(gè)階段，在H.pylori相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要意義，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。

Prxs家族是一類分子量在20～30 kDa之間的非硒依賴的過(guò)氧化物酶蛋白，Prxs家族具有過(guò)氧化氫酶活性，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫水平具有重要作用。Prxs還可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子水平調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫水平變化，介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。哺乳動(dòng)物中至少含有六種Prxs單體。根據(jù)保守的半胱氨酸數(shù)量和催化機(jī)制，將其分為2-Cys(Prx1-4)、1-Cys(Prx6)和不典型2-Cys(Prx5)［10］。Prx6作為其中唯一的1-Cys Prx，具有過(guò)氧化物酶和磷脂酶A2的活性［11］。Prx6具有限制ROS水平及維持鈣穩(wěn)態(tài)的作用［12-13］，避免細(xì)胞受氧化應(yīng)激損傷，從而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。研究表明Prx6參與多個(gè)氧化應(yīng)激相關(guān)的腫瘤的發(fā)生［14］。

本研究結(jié)果顯示，Prx6在慢性淺表性胃炎中已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，隨著胃黏膜病變的進(jìn)展，Prx6慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生及異型增生組織中的表達(dá)逐漸增加;本研究中H.pylori感染者胃黏膜組織中Prx6的表達(dá)率明顯高于未感染者，提示H.pylori感染促進(jìn)了Prx6的表達(dá)。H.pylori感染刺激胃黏膜細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫、羥自由基和超氧陰離子等活ROS，ROS可能通過(guò)調(diào)控 NF-κB 的活性［15-16］，啟動(dòng) Nrf2/ARE［17］促進(jìn)抗氧化蛋白Prx6基因的表達(dá)，從而減輕ROS所致的胃黏膜損傷，防止病變進(jìn)一步進(jìn)展。如果H.pylori感染持續(xù)存在，有可能引起ROS產(chǎn)生過(guò)多，引起機(jī)體氧化—抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致Prx6表達(dá)反而下降，加快了胃黏膜病變的演化過(guò)程。

總之，本研究提示在胃黏膜病變?cè)缙陔A段，H.pylori感染可以增加胃黏膜Prx6表達(dá)，以抵抗H.pylori所致的活性氧損傷。隨著胃黏膜病變演化的進(jìn)展，會(huì)出現(xiàn)氧化—抗氧化系統(tǒng)失衡，Prx6表達(dá)反而下降，導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。

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The relationship between Helicobacter pylori infection and Peroxiredoxin 6 expression in the development of gastric mucosa lesions

GUO Hongwei1，ZHU Yali2，ZHANG Xiuru3，YANG Guibin1
1.Department of Gastroenterology;2.Department of Comprehensive Internal Medicine;3.Department of Pathology，Aerospace Clinical Medical School of Beijing University，Aerospace Center Hospital，Beijing 100049，China

ObjectiveTo investigate the expression of Peroxiredoxin 6(Prx6)proteins in gastric mucosal lesions and to evaluate the effect of Helicobacter pylori(H.pylori)infection on Prx6 expression in development of gastric mucosal lesions.Methods104 gastroscopic biopsy samples were divided into four groups of different gastric mucosa lesions according to pathologic findings:chronic superficial gastritis，chronic atrophic gastritis，intestinal metaplasia and dysplasia.Expression of Prx6 was examined by PowerVisionTM immunohistochemistry，and H.pylori status was determined by Warthin-Starry stain and rapid urease test.ResultsThe positive rates of Prx6 in biopsy samples with chronic superficial gastritis，chronic atrophic gastritis，intestinal metaplasia and dysplasia tissues were 39.4%(13/33)，80.0%(20/25)，93.8%(30/32)and 92.9%(13/14)，and the positive overexpression rates of Prx6 were 15.2%(5/33)，44.0%(11/25)，81.3%(26/32)and 85.7%(12/14)respectively.Both positive rates of Prx6 expression and overexpression in biopsy samples with H.pylori infection were significantly higher than those without H.pylori infection(P ＜0.05).The Prx6 expression in chronic superficial gastritis and chronic atrophic gastritis tissues with positive H.pylori was significantly higher than that with negative H.pylori(P ＜0.05)，but it was not observed in intestinal metaplasia and dysplasia tissues.ConclusionPrx6 expression rate in gastric precancerous lesion tissues is increased compared with chronic superficial gastritis.H.pylori infection may also play a role in the early development of gastric precancerous lessions associated with Prx6.

Gastric precancerous lesions;Helicobacter pylori;Peroxiredoxin 6

R573

A

1006－5709(2012)08－0698－04

2012-02-01

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.004

郭紅偉，在讀碩士研究生，研究方向:幽門螺桿菌與胃癌關(guān)系。E-mail:guowei332@126.com

楊桂彬，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:幽門螺桿菌與上胃腸道疾病。E-mail:ygb@medmail.com.cn