IL-4、IL-13在慢性綜合應(yīng)激模型大鼠Cajal細(xì)胞損傷中的作用

鄧 琴，陳明鍇，張 麗，羅和生

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430060

IL-4、IL-13在慢性綜合應(yīng)激模型大鼠Cajal細(xì)胞損傷中的作用

鄧 琴，陳明鍇，張 麗，羅和生

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430060

目的 觀察慢性綜合應(yīng)激模型大鼠中IL-4及IL-13的表達(dá)變化，并初步探討其在Cajal細(xì)胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)損傷中的作用。方法 健康成年SD雄性大鼠20只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組大鼠制備慢性綜合應(yīng)激模型，曠場實(shí)驗(yàn)鑒定造模成功后，采用ELISA法測定血清IL-4、IL-13的濃度，免疫熒光法觀察腸道肌間神經(jīng)叢TMEM16A的表達(dá)與分布。結(jié)果 模型組和對照組大鼠血清IL-4濃度分別為(8.09±0.97)pg/mL和(6.98±0.69)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.363，P＜0.01)，血清 IL-13 濃度分別為(5.96 ±0.67)pg/mL 和(5.26 ±0.73)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.322，P ＜0.05);熒光顯微鏡下觀察腸道平滑肌間神經(jīng)叢TMEM16A有陽性表達(dá)，模型組在不同節(jié)段腸道肌間神經(jīng)叢為陽性表達(dá)的細(xì)胞減少且分布稀疏。結(jié)論 慢性綜合應(yīng)激時(shí)，IL-4、IL-13等Th2免疫應(yīng)答相關(guān)炎性因子產(chǎn)生增加，其可能通過調(diào)控TMEM16A表達(dá)參與了ICC的損傷。

IL-4;IL-13;慢性綜合應(yīng)激;TMEM16A;ICC

胃腸運(yùn)動(dòng)異常和內(nèi)臟高敏感是功能性胃腸病(functional gastrointestinal disorders，F(xiàn)GIDs)的主要臨床表現(xiàn)，而ICC是胃腸運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞，是慢波活動(dòng)的基礎(chǔ)。當(dāng)前，F(xiàn)GIDs發(fā)病率逐年上升，研究證實(shí)，不良心理社會因素與FGIDs發(fā)生密切相關(guān)。FGIDs發(fā)病過程中存在各種胃腸激素、神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥介質(zhì)等生物活性物質(zhì)的變化［1］，文獻(xiàn)報(bào)道與我們的前期研究表明，炎性細(xì)胞因子可損傷ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及功能、影響ICC與神經(jīng)末梢間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但其作用途徑及方式并不清楚［2］，本研究擬觀察慢性綜合應(yīng)激模型大鼠血清中IL-4及IL-13的表達(dá)變化并初步探討其在Cajal細(xì)胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g，來自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與儀器 大鼠IL-4、IL-13 ELISA試劑盒均由武漢潔洋盛生生物科技有限公司提供，TMEM16A免疫熒光抗體由武漢三鷹生物科技有限公司提供，加樣步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。主要實(shí)驗(yàn)儀器:酶標(biāo)儀(美國伯樂天呈北京分公司);自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)(上海福瑪實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);電熱恒溫水箱(北京長安科學(xué)儀器廠);切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);包埋機(jī)(浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組:健康成年SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g。為適應(yīng)環(huán)境，先在自由飲食、每日光/暗周期各12 h交替、背景噪音為(40±10)Db、溫度20℃條件下飼養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分為對照組和模型組，每組10只。

1.3.2 造模及鑒定:參照文獻(xiàn)［3］，采用經(jīng)典慢性綜合應(yīng)激致抑郁模型方法。制作方法:大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，再接受21 d各種不同的應(yīng)激，包括冰水游泳(4 ℃，5 min)、熱應(yīng)激(45 ℃，5 min)、搖晃(1 次Ps，15 min)、夾尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(48 h)、足底電擊(電流強(qiáng)度1 mA，間隔1 min刺激1次，共30次)，每種刺激2～3次并且相鄰2 d刺激種類不同。鑒定:造模前后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)鑒定造模是否成功。曠場大小為120 cm×90 cm×35 cm，將大鼠放入正中點(diǎn)，觀察大鼠的活動(dòng)情況3 min。測定指標(biāo)包括:(1)水平和垂直穿越總距離;(2)直立次數(shù)(兩前肢離地1 cm以上的次數(shù));(3)糞便次數(shù)(因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)中大鼠每次排便均為1粒，故以糞便粒數(shù)表示糞便次數(shù)，此指標(biāo)由觀察者自行記錄)。

1.3.3 血清的采集與組織取材:造模成功后，處死動(dòng)物，心房取血5 mL，裝入潔凈的試管中，室溫靜置1 h，40℃過夜。1500 r/min離心30 min，吸取上部血清，－70℃保存?zhèn)溆谩Ｆ矢购笱杆俜蛛x并剪取腸道組織，取材后制作石蠟切片備用。

1.3.4 IL-4、IL-13測定:采用雙抗體夾心 ELISA 法測定血清IL-4、IL-13含量。檢測過程按照試劑盒說明書操作。主要步驟:(1)酶標(biāo)的生物素抗體;(2)加入酶的底物發(fā)生顯色反應(yīng);(3)酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光度;(4)通過標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算樣品的IL-4和IL-13的含量。

1.3.5 TMEM16A表達(dá)及分布檢測:采用免疫熒光法觀察TMEM16A在腸道肌間神經(jīng)叢表達(dá)及分布。石蠟切片脫蠟，用PBS沖洗后置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10 min低火至沸。自然冷卻并用PBS洗滌后放入3%過氧化氫溶液中，室溫下孵育10 min。PBS洗滌后用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉20 min。甩干BSA液加入約50 μL適當(dāng)稀釋的一抗(TMEM16A sc135235，1∶200)覆蓋到組織，4℃過夜。PBS洗滌后加入50～100 μL兔抗熒光二抗，避光室溫下孵育50 min～1 h。避光PBS洗滌后加入50～100 μL Hoechst避光染核5 min。PBS洗滌稍甩干后抗熒光淬滅封片劑封片，4℃避光保存待拍照用。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性綜合應(yīng)激對大鼠生物學(xué)行為的影響 采用曠場實(shí)驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)行為。給予慢性綜合應(yīng)激，兩組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)無明顯差異(P＞0.05)。給予慢性綜合應(yīng)激21 d后，進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)鑒定，模型組大鼠水平和垂直穿越總距離反映興奮性減少(P＜0.05，t=2.532);直立次數(shù)反映對環(huán)境的適應(yīng)程度減少(P＜0.01，t=3.405);糞便粒數(shù)反映緊張程度增多(P ＜0.05，t=3.144，見表1)。提示受慢性綜合應(yīng)激刺激的大鼠出現(xiàn)抑郁癥狀，即造模成功。

表1 慢性綜合應(yīng)激刺激21 d后兩組大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果比較±s)Tab 1 Comparison of open-fieldResultsfrom the model group and control group after 21-day chronic and comprehensive stress induction(ˉx ± s)

表1 慢性綜合應(yīng)激刺激21 d后兩組大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果比較±s)Tab 1 Comparison of open-fieldResultsfrom the model group and control group after 21-day chronic and comprehensive stress induction(ˉx ± s)

與對照組相比較，*P＜0.05

組別 穿越總距離(cm)直立次數(shù) 糞便粒數(shù)對照組1433.2 ±633.21 21.5 ±7.99 0.9 ±0.74模型組 905.3 ±340.07* 12.3 ±5.54* 2.5 ±1.65*

2.2 慢性綜合應(yīng)激對大鼠血清IL-4、IL-13含量的影響 慢性綜合應(yīng)激模型大鼠和對照組大鼠血清IL-4濃度分別為(8.09 ±0.97)pg/mL 和(6.98 ±0.69)pg/mL，模型組高于對照組(P＜0.01，t=3.363);血清 IL-13濃度分別為(5.96±0.67)pg/mL 和(5.26 ±0.73)pg/mL，模型組高于對照組(P ＜0.05，t=2.322)。

2.3 慢性綜合應(yīng)激對大鼠腸道肌間神經(jīng)叢TMEM16A表達(dá)和分布的影響 運(yùn)用免疫熒光方法在熒光顯微鏡下觀察，模型組和對照組大鼠腸道肌間神經(jīng)叢均可見TMEM16A表達(dá)陽性的細(xì)胞散在分布，且模型組在不同節(jié)段腸道肌間神經(jīng)叢表達(dá)為陽性的細(xì)胞數(shù)量減少且分布稀疏(見圖1)。

3 討論

不良心理社會因素與FGIDs的發(fā)生密切相關(guān)。我們前期有關(guān)慢性綜合應(yīng)激致抑郁模型大鼠的研究提示，慢性綜合應(yīng)激大鼠表現(xiàn)出腸道運(yùn)動(dòng)異常、大便性狀改變并伴有ICC超微結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的損傷［4］。有文獻(xiàn)［2］報(bào)道，炎性細(xì)胞因子可損傷ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及功能，影響ICC與神經(jīng)末梢間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但其作用途徑及方式并不清楚。本研究采用慢性綜合應(yīng)激致抑郁的方法，通過長期、慢性、不可預(yù)見的刺激模擬不良心理社會因素暴露，研究模型大鼠血清中IL-4及IL-13的表達(dá)變化，并初步探討其引起ICC損傷的可能途徑及作用，為進(jìn)一步探討FGIDs發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

圖1 對照組及模型組大鼠回腸、空腸、近段結(jié)腸、遠(yuǎn)端結(jié)腸肌層TMEM16A表達(dá)(熒光顯微鏡200×)A:正常組大鼠回腸肌層TMEM16A表達(dá);B:模型組回腸肌層TMEM16A表達(dá);C:正常組空腸肌層TMEM16A表達(dá);D:模型組空腸肌層TMEM16A表達(dá);E:正常組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸肌層TMEM16A表達(dá);F:模型組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸肌層TMEM16A表達(dá);G:正常組大鼠近端結(jié)腸肌層TMEM16A表達(dá);H:模型組大鼠近端結(jié)腸肌層TMEM16A表達(dá)Fig 1 The expression of TMEM16A in the muscular layer of the ileum/the jejunum/the distal colon/the proximate colon of rats in the control group and the model group(fluorescence microscope 200×)A:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the ileum of rats in the control group;B:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the ileum of rats in the model group;C:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the jejunum of rats in the control group;D:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the jejunum of rats in the model group;E:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the distal colon of rats in the control group;F:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the distal colon of rats in the model group;G:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the proximate colon of rats in the control group;H:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the proximate colon of rats in the model group

白細(xì)胞介素4(Interleukin 4，IL-4)和白細(xì)胞介素13(Interleukin 13，IL-13)主要由Th2型T輔助淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)相似，共受體和信號途徑都通過結(jié)合靶細(xì)胞上的功能性受體發(fā)揮生物活性，且二者的生物學(xué)功能在許多方面有相似之處。研究顯示［5］，在腸道急性感染期，腸道肌層 IL-4、IL-13、TGF-β1、還氧化酶(cyclooxygenase 2，COX-2)表達(dá)增加，Kindt等［6］也發(fā)現(xiàn)FGIDs患者體內(nèi)呈現(xiàn)以IL-5、IL-13等Th2細(xì)胞因子為主的炎癥反應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)慢性綜合應(yīng)激模型大鼠血清中IL-4、IL-13等Th2免疫應(yīng)答相關(guān)炎性因子增加，其中血清IL-4水平明顯增高與Pecaut對失重大鼠抑郁模型的研究結(jié)果一致［7］;另有研究發(fā)現(xiàn)［2］，炎癥細(xì)胞可能通過釋放大量炎癥因子作用于ICC細(xì)胞，破壞ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及功能，影響胃腸道運(yùn)動(dòng)，此外，炎癥細(xì)胞浸潤腸道肌層還可導(dǎo)致ICC與神經(jīng)末梢間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，影響平滑肌收縮;我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，慢性綜合應(yīng)激模型大鼠中ICC的超微結(jié)構(gòu)、ICC網(wǎng)絡(luò)損傷可能與炎性因子有關(guān)［4］。上述研究提示，慢性綜合應(yīng)激時(shí)IL-4、IL-13等Th2免疫應(yīng)答相關(guān)炎性因子增加可能參與了ICC損傷所引起的胃腸道異常運(yùn)動(dòng)。

TMEM16A是一種最近發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白，是鈣離子激活氯通道的結(jié)構(gòu)亞單位，而鈣離子激活氯通道是維持ICC正常生理功能產(chǎn)生起搏電位的最重要環(huán)節(jié)，此外，TMEM16A還是ICC選擇性分子標(biāo)志物，在胃腸道TMEM16A僅表達(dá)于ICC而不表達(dá)在平滑肌細(xì)胞和肌間的肥大細(xì)胞上，因此能更準(zhǔn)確地反映ICC的數(shù)量、分布及其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)在熒光顯微鏡下腸道肌間神經(jīng)叢TMEM16A表達(dá)陽性的細(xì)胞減少且分布稀疏，一定程度上反映了ICC數(shù)量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化或破壞。

目前已知，IL-4、IL-13可正反饋調(diào)節(jié)由Th2分化的特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子6(signal transducers and activators of transcription，STAT6)，使其產(chǎn)生新的Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-13。并且STAT6第641位為酪氨酸殘基，其磷酸化在IL-4誘導(dǎo)的STAT6激活中起著關(guān)鍵作用，當(dāng)IL-4與特異性受體結(jié)合后，可活化酪氨酸激酶系統(tǒng)(JAKs)，引起酪氨酸殘基磷酸化而誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)及其蛋白質(zhì)合成。JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路是眾多細(xì)胞因子信號傳遞過程中的重要環(huán)節(jié)，在哮喘所致氣道炎癥、氣道重塑等過敏性表現(xiàn)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用;IL-4引起氣道平滑肌收縮也被證明與JAK/STAT 通路相關(guān)。有學(xué)者證實(shí)［8］，IL-4、IL-13 可激活氣道上皮細(xì)胞中STAT6刺激上皮細(xì)胞增生，促進(jìn)合成和分泌大量黏液。另有研究［9］發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲感染后PI-IBS模型小鼠腸道平滑肌的高收縮性具有STAT6依賴性。據(jù)此推測，L-4、IL-13等Th2相關(guān)炎性因子對ICC損傷所致腸道平滑肌異常收縮，可能與JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有一定的聯(lián)系，但其具體機(jī)制尚不明確。Caputo等［10］發(fā)現(xiàn)用濃度為10 ng/mL的IL-4刺激支氣管上皮細(xì)胞24 h后，可在基因轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)TMEM16A的表達(dá)增加。另有研究［11］發(fā)現(xiàn)，TMEM16A mRNA在小鼠空腸腸肌層(Auerbach’s plexus，ICCAP)和深肌間(deep muscular plexus，ICC-DMP)ICC明顯高表達(dá)，而慢波活動(dòng)起源于ICC-AP，故TMEM16A可能參與腸道起搏電流的形成。通過進(jìn)一步研究TMEM16A基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)［12］，敲除 TMEM16A基因后，模型小鼠胃平滑肌收縮的頻率和振幅明顯下降，且出現(xiàn)節(jié)律紊亂，該研究提示，TMEM16A的表達(dá)與胃腸功能異常運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)。

綜上所述，慢性綜合應(yīng)激所致抑郁時(shí)，模型大鼠血清中Th2免疫應(yīng)答相關(guān)炎性因子IL-4、IL-13水平顯著性增高，其可能通過JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致TMEM16A表達(dá)異常，再通過TMEM16A的介導(dǎo)引起ICC損傷，最終出現(xiàn)類似于臨床的胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙。而IL-4、IL-13、JAK/STAT信號通路、TMEM16A 表達(dá)、ICC、胃腸道平滑肌的運(yùn)動(dòng)、上下游之間的相互影響和作用途徑值得進(jìn)一步深入探討。

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The roles of IL-4 and IL-13 in the damage of interstitial cells of Cajal in model rats treated with chronic and comprehensive stress

DENG Qin，CHEN Mingkai，ZHANG Li，LUO Hesheng
Department of Gastroenterology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China

ObjectiveTo observe the expression of IL-4 and IL-13 in rats treated with chronic and comprehensive stress and explore their roles in the damage of interstitial cells of Cajal.MethodsTwenty male SD rats were randomly divided into 2 groups:the model group(n=10)and the control group(n=10).Rats in model group were treated with chronic and comprehensive stress.Open-field test was used to confirm the accomplishment of model.The serum concentration of IL-4 and IL-13 were determined by ELISA and the expression of TMEM16A in the myenteric plexus was detected by immunofluorescence.ResultsThe mean serum concentration of IL-4 in the model group(8.09 pg/mL ±0.92 pg/mL)was significantly higher than that in the control group(6.98 pg/mL ±0.69 pg/mL)(t=3.363，P ＜ 0.01)，while the mean serum concentration of IL-13 in the model group(5.96 pg/mL ±0.67 pg/mL)was also significantly higher than that in the control group(5.26 pg/mL ± 0.73)pg/mL(t=2.322，P ＜ 0.05).Positive expression of TMEM16A in the myenteric plexus was observed under the fluorescence microscope.Compared with the control group，the expression of TMEM16A in the model group were decreased in all sections of the intestine.ConclusionIn model rats treated with chronic and comprehensive stress，the expression of Th2-related cytokines(IL-4 and IL-13)were increased，and it might result in the damage of interstitial cells of Cajal by affecting the expression of TMEM16A.

IL-4;IL-13;Chronic and comprehensive stress;TMEM16A;ICC

R574

A

1006－5709(2012)08－0750－04

2012-03-18

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.019

國家自然科學(xué)基金(81170350);湖北省自然科學(xué)基金(2009CDB283);武漢大學(xué)自主科研基金(3082018)

陳明鍇，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail:kaimingchen@163.com