重組人p53腺病毒感染對攜帶不同p53狀態胃癌細胞增殖和凋亡的影響

劉明月，王晚萍，周 云

1.河南省人民醫院腫瘤科，河南鄭州 450003;2.山西省長治市人民醫院

重組人p53腺病毒感染對攜帶不同p53狀態胃癌細胞增殖和凋亡的影響

劉明月1，王晚萍2，周 云1

1.河南省人民醫院腫瘤科，河南鄭州 450003;2.山西省長治市人民醫院

目的 研究重組人p53腺病毒感染不同p53狀態胃癌細胞對其p53蛋白表達、生長抑制率、細胞周期與凋亡率的影響。方法 不同濃度重組人p53腺病毒感染3種不同p53狀態胃癌細胞，即含野生型p53基因的細胞(wild-type)、含突變型p53基因的細胞(mutant-type)、含空載質粒即p53基因缺失的細胞(vector-cell)。48 h后，用Western blotting法檢測p53蛋白在3種胃癌細胞中的表達;用MTT法測定重組人p53腺病毒感染3種胃癌細胞的生長抑制率，用流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡率。結果

rAd-p53感染3種胃癌細胞48 h后p53蛋白表達陽性，對照組p53基因缺失的胃癌細胞無表達，對照組含野生型p53基因的細胞和含突變型p53基因的細胞弱表達。rAd-p53對3種胃癌細胞的生長抑制效應在一定的濃度范圍內呈劑量依賴性，而與細胞內在的p53狀態無關。含野生型p53基因的細胞、含突變型p53基因的細胞和p53基因缺失的細胞感染rAd-p53后誘導G2/M期阻滯與細胞凋亡率分別增加2.5、3.6、3.2倍。結論 腺病毒介導p53基因感染3種不同p53狀態胃癌細胞改變細胞內在的p53狀態，p53蛋白表達、生長抑制率、細胞周期分布、凋亡率均與細胞內在的p53狀態無關。

胃癌;重組人p53腺病毒;基因治療

p53是一種抑癌基因，控制著與腫瘤發生、發展相關的多種基因的表達。正常狀態下p53基因為野生型，能維持細胞正常生長，抑制惡性增殖，當其發生突變或缺失，則不但喪失了正常p53基因的功能，而且獲得癌基因的功能，使得衰老細胞、異常細胞不能按正常程序死亡而不斷地增殖，導致腫瘤的發生。包括胃癌在內的50%以上的腫瘤存在p53突變。隨著研究的深入，針對p53基因的治療開始成為抗腫瘤治療的一種手段。本研究以重組人p53腺病毒感染3種不同p53狀態人胃癌細胞系BGC-823，觀察對其增殖和凋亡的影響，為重組人p53腺病毒在抗胃癌治療過程中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 含3種不同p53狀態人胃癌細胞系BGC-823:即含野生型p53基因的細胞(BGC-823-wild-type p53)、含突變型p53基因的細胞(BGC-823-mutant-type p53)、含空載質粒即p53基因缺失的細胞(BGC-823-vector-cell p53)(購自北京腫瘤防治研究所)。重組人p53腺病毒注射液(rAd-p53)，深圳賽百諾基因技術有限公司產品。p53單抗(鼠抗人IgG，美國Santa Cruz)、免疫組化二抗(美國Santa Cruz)、流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)、酶標儀(美國Stat Fax-2100)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:3種胃癌細胞 BGC-823在含有10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養液中生長，并置于37℃、5%CO2的飽和濕度條件下常規培養。

1.2.2 實驗分組:依據預實驗結果單藥藥物濃度選取4個濃度組，藥物濃度的選取參考常規用藥時血藥峰值濃度而定。具體濃度如下:rAd-p53(vp/mL)5×106、5 ×107、5 ×108、5 ×109，實驗組:含細胞，加入用培養液稀釋的不同濃度的藥物，每濃度組重復6～8孔。對照組:含細胞，只加等體積的培養液。

1.2.3 Western blotting法檢測 p53蛋白在 p53野生型、含突變型和缺失型胃癌細胞中的表達:用蛋白裂解液提取5×107vp/mL rAd-p53 1 mL感染48 h后的p53野生型、含突變型和缺失型胃癌細胞以及對照組3種細胞的總蛋白，考馬斯亮藍標準曲線法測蛋白濃度，加入2×buffer混勻后沸水浴上煮沸5 min，冷卻，－20℃保存備用。取75～100 μg蛋白在10%SDS-PAGE膠上電泳，然后轉膜、雜交，一抗為鼠抗人p53蛋白單克隆抗體。

1.2.4 MTT法檢測rAd-p53感染對p53野生型、含突變型和缺失型胃癌細胞的生長抑制率:細胞接種于96孔板，設對照組、4種濃度rAd-p53組，每孔加入MTT液20 μL，37℃ CO2培養箱培養4 h，棄培養液，各孔加200 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶聯儀在570 nm波長下檢測每孔的吸光值(OD)，相同藥物設計組重復3～5板，按下列公式計算細胞生長抑制率:細胞生長抑制率(%)=(1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.2.5 流式細胞儀分析細胞周期分布和凋亡:根據MTT結果選取rAd-p53濃度5×107vp/mL行流式細胞分析。p53野生型、含突變型和缺失型胃癌細胞經rAd-p53感染48 h后收獲細胞，行流式細胞儀分析細胞周期分布與凋亡率。

1.3 統計學處理 實驗結果以均值±標準差(x－±s)表示;方差分析、均數間的兩兩比較采用LSD法;單樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義;利用SPSS 10.0軟件進行統計學處理。

2 結果

2.1 Western blotting觀察外源p53基因表達 5×107vp/mL rAd-p53感染3種胃癌細胞48 h后在53 KD位置上均有一條清晰的雜交帶，對照組不加rAdp53的p53缺失型胃癌細胞在同一位置無雜交帶，而對照組p53野生型和突變型胃癌細胞則在53 KD處有很淺的一條雜交帶(見圖1)。

圖1 p53蛋白在3種細胞株中的Western blotting結果 1:含野生型p53基因的細胞;2:含突變型p53基因的細胞;3:含空載質粒的細胞;4:rAd-p53感染后的含野生型p53基因細胞;5.rAd-p53感染后的含突變型p53基因細胞;6:rAd-p53感染后的空質粒p53基因細胞.Fig 1 Western blotting analysis of P53 protein expression in gastric cancer cells with three different p53 expression status 1:BGC-823 cells with wild type p53 gene control;2:BGC-823 cells with mutant p53 gene control;3:BGC-823 cells with p53 gene deletion control;4:BGC-823 cells with wild type p53 gene+rAd-p53;5:BGC-823 cells with mutant p53 gene+rAdp-53;6:BGC-823 cells with p53 gene deletion+rAd-p53

2.2 MTT法檢測rAd-p53感染3種胃癌細胞48 h后的生長抑制率 不同濃度的rAd-p53作用48 h后，3種胃癌細胞生長均受到不同程度的抑制，所有實驗組與對照組間及不同濃度實驗組之間OD值比較差異有統計學意義(P＜0.01)。rAd-p53感染3種不同p53狀態的BGC-823細胞，同濃度組3種細胞OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05，見表1)。

2.3 流式細胞儀檢測rAd-p53感染3種胃癌細胞的細胞周期變化與凋亡效應 p53野生型、突變型和缺失型胃癌細胞感染rAd-p53后誘導G2/M期阻滯與細胞凋亡出現Sub-G1峰;經細胞流式圖分析知，各周期變化與對照組比較差異均有顯著性。rAd-p53感染48 h后:對于p53野生型細胞，與空白對照組比，凋亡率增加2.6倍;對于p53突變型細胞，凋亡率增加3.5倍;對于p53缺失型細胞，凋亡率增加3.2倍;rAd-p53感染3種細胞48 h后均表現出G2/M期的強力阻斷作用(見表2)。

3 討論

p53基因是一種對于DNA損傷作出應答反應的“看家基因”，在腫瘤細胞內存在的受損DNA是p53基因表達的重要激活因素［1］。rAd-p53是攜帶有外源p53基因的腺病毒載體，可引起腫瘤細胞程序性死亡，而對正常細胞無損傷。rAd-p53對細胞只發生一次性感染，導入的p53可以表達生成p53蛋白質，發揮生物學效應。rAd-p53感染3種胃癌細胞后12 h，p53蛋白在核內有表達，36 h呈強陽性表達，48 h表達最強，到第5天則已為弱陽性表達，第6天接近對照組［2］。重組p53腺病毒與氟尿嘧啶聯合，有協同抗結腸癌作用［3］。可以增強胃癌細胞對于化療的敏感性［4］。

表1 不同濃度rAd-p53作用p53野生型、突變型和缺失型胃癌細胞生長抑制率比較(±s)Tab 1 Comparison of proliferation inhibition of BGC-823 cells with wild type，mutant p53 gene and p53 gene deletion in different levels of recombinant adenovirus p53(x－±s)

表1 不同濃度rAd-p53作用p53野生型、突變型和缺失型胃癌細胞生長抑制率比較(±s)Tab 1 Comparison of proliferation inhibition of BGC-823 cells with wild type，mutant p53 gene and p53 gene deletion in different levels of recombinant adenovirus p53(x－±s)

組別 例數 BGC-823-wild-type p53 BGC-823-mutant-type p53 BGC-823-vector cell p53F P對照組32 1.21 ±0.12 1.22 ±0.11 1.20 ±0.02 0.63 ＞0.05劑量 1 32 1.01 ±0.08 0.98 ±0.05 0.98 ±0.09 0.41 ＞0.05劑量 2 32 0.92 ±0.06 0.91 ±0.05 0.91 ±0.04 0.23 ＞0.05劑量 3 32 0.86 ±0.05 0.85 ±0.04 0.85 ±0.11 0.21 ＞0.05劑量 4 32 0.79 ±0.09 0.78 ±0.05 0.78 ±0.11 0.16 ＞0.05 F＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 11.02 55.31 55.65 P

表2 rAd-p53感染p53野生型、突變型和缺失型胃癌細胞的細胞周期及凋亡率比較 (±s)Tab 2 Comparison of cell cycle and apoptosis rates of BGC-823 cells with wild type，mutant p53 gene and p53 gene deletion transfected with recombinant adenovirus p53(x－±s)

表2 rAd-p53感染p53野生型、突變型和缺失型胃癌細胞的細胞周期及凋亡率比較 (±s)Tab 2 Comparison of cell cycle and apoptosis rates of BGC-823 cells with wild type，mutant p53 gene and p53 gene deletion transfected with recombinant adenovirus p53(x－±s)

p53野生型、突變型、缺失型細胞組與對照組G2/M比較，★F=652.35★P＜0.001;Sub-G1比較，★F=531.04★P＜0.001

細胞系 G1(%) S(%) G2/M(%)★ Sub-G1(%)★對照52.80 ±0.51 28.70 ±0.40 18.50 ±0.43 2.59 ±0.14 BGC-823-wild-type p53 39.60 ±0.32 14.60 ±0.51 45.70 ±0.60 9.33 ±1.27 BGC-823-mutant-type p53 38.40 ±0.64 15.80 ±0.69 45.80 ±0.79 11.76 ±2.33 BGC-823-vector cell p53 39.80 ±0.78 17.30 ±0.64 42.90 ±1.23 10.97 ±1.50

本研究在不同濃度的rAd-p53作用下，3種胃癌細胞對p53的表達明顯增加，生長受到不同程度的抑制，rAd-p53對3種細胞的生長抑制呈劑量依賴性;在相同濃度下rAd-p53對3種細胞的生長抑制作用無顯著性差異(P＞0.05)。這說明，rAd-p53通過表達p53蛋白來抑制腫瘤細胞生長，這種作用與rAd-p53的感染劑量相關，與胃癌細胞內在的p53狀態無關。研究顯示，rAd-53感染腫瘤細胞可抑制腫瘤細胞增殖及促進凋亡，而與腫瘤細胞內在的p53狀態無關［5］。這為rAd-p53更廣泛的用于臨床各種腫瘤的治療提供了可靠的實驗依據。

作為重要的腫瘤抑制基因，p53在凋亡的誘導中發揮著重要作用，其激活凋亡途徑主要有:一是依賴序列特異性反式激活途徑，誘導表達p53下游的凋亡相關基因 p21、mdm2、GADD45等;二是與涉及 DNA合成、修復及凋亡的蛋白結合，調節凋亡的發生。p53可引起G0/G1期和G2/M期阻滯［6-7］，且G2/M阻滯的細胞更易導致凋亡。

本研究中，rAd-p53感染3種細胞48 h后:野生型細胞與其對照組比:出現G2/M期明顯阻滯，凋亡率增加2.2倍;突變型細胞與其對照相比G2/M期凋亡率增加3.2倍;p53缺失型細胞與其對照組相比，G2/M期阻滯，凋亡率增加3.2倍;rAd-p53感染3種細胞48 h后均表現出G2/M期的強力阻斷作用，提示rAdp53誘導的凋亡可能是通過G2/M期的阻滯來實現的，細胞周期的阻斷可能是細胞凋亡的重要前提。

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The effect of recombinant adenovirus p53 transfection on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells with different types of p53

LIU Mingyue1，WANG Wanping2，ZHOU Yun1
1.Department of Oncology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003;2.Shanxi Changzhi People’s Hospital，China

ObjectiveTo Study the effect of recombinant adenovirus p53 transfection on protein expression，growth inhibition rate，cell cycles and apotosis rate cells with different types of p53.Methodsthe recombinant adenovivus p53 in different and apotosis concentrations were infected.BGC-823 with three different p53 status:BGC-823 cells with wild-type p53 gene，BGC-823 cells with mutant type p53 gene and BGC-823 cells with p53 gene deletion were transfected with recombinant human p53 adenovirus.After 48 h，the expression of p53 protein in three gastric cancer cell lines was detected by Western blotting method;cell proliferation was determined by MTT，cell-cycle distributions and apoptosis rates were detected by Flow Cytometry.ResultsThree types of gastric cancer cells transfected with rAd-p53 expressed p53 protein.However，in the control groups，cells with wild type p53 and cells with mutant p53 express P53 weakly，cells with p53 gene deletion did not express p53 protein.Proliferation of three gastric cancer cell lines were rAd-p53 dose-dependent，regardless of the cell-endogenous p53 status.Induced G2/M phase arrests and apoptosis rates of cells with wild type p53，cells with mutant p53 and cells with p53 gene deletion transfected with rAd-p53 increased 2.5，3.6，3.2 times than controll groups，individually.ConclusionTransfected with adenovirus-mediated p53 gene，three different p53 types gastric cancer cells changed the p53 status.P53 protein expression，growth inhibitions rate，apoptosis rates and cell cycles were independent with cell-endogenous p53.

Gastric cancer;Recombinant adenovirus p53;Gene therapy

R735.2

A

1006－5709(2012)08－0740－03

2012-07-10

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.016

王晚萍，主治醫師，研究方向:呼吸道腫瘤的綜合治療。

E-mail:wanping1124@163.com