貴州省幽門螺桿菌臨床菌株的抗生素耐藥現狀

劉 苓，胡 林，劉婭琳，周 力，車筑萍，譚慶華

貴州省貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院1.消化內科;2.內鏡中心，貴州貴陽 550004

貴州省幽門螺桿菌臨床菌株的抗生素耐藥現狀

劉 苓1，胡 林1，劉婭琳1，周 力1，車筑萍2，譚慶華2

貴州省貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院1.消化內科;2.內鏡中心，貴州貴陽 550004

目的 檢測貴州省幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori，H.pylori)臨床菌株對多種抗生素的耐藥率，并分析甲硝唑(MTZ)、克拉霉素(CLA)、阿莫西林(AMO)耐藥菌株的臨床特征。方法 以貴州地區(qū)30株培養(yǎng)成功的H.pylori臨床菌株為研究對象，采用Kirby-Bauer及E-test法測定菌株對MTZ、CLA、AMO等多種抗生素的耐藥性。分析MTZ、CLA、AMO耐藥菌株與敏感菌株患者性別、年齡及疾病種類的差異。結果 Kirby-Bauer法顯示H.pylori臨床菌株對AMO、左氧氟沙星、慶大霉素、CLA、四環(huán)素、頭孢呋肟、復方新諾明的耐藥率分別為 20.00%、3.33%、13.33%、30.00%、6.67%、0、0;E-test法顯示 H.pylori臨床菌株對 MTZ、AMO、CLA 耐藥率分別為63.33%、26.67%、33.33%;兩種檢查方法檢測結果無明顯差異;男性患者 MTZ的耐藥率(77.78%)較女性患者(41.67%)高(P＜0.05);30～60歲年齡組患者MTZ的耐藥率更高(P＜0.05);CLA和AMO的耐藥率與疾病種類、性別、年齡無明顯關系(P＞0.05)。結論 貴州地區(qū)H.pylori臨床菌株的耐藥現狀不容忽視，以男性消化性潰瘍患者年齡在30～60歲對MTZ的耐藥率較高。

幽門螺桿菌;抗生素耐藥

根除幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori，H.pylori)是臨床治療H.pylori相關性上消化道疾患的重要策略，根除H.pylori不僅能加速消化性潰瘍的愈合，而且能顯著降低潰瘍復發(fā)率，也可預防胃黏膜癌前變化如萎縮性胃炎、腸化生、胃癌的發(fā)生，故對上消化道疾病的防治具有重要的意義。目前，三聯療法是推薦的一線根除H.pylori治療方案，常用的抗生素有甲硝唑(Metronidazole，MTZ)、克拉霉素(Carithromycin，CLA)和阿莫西林(Amoxicillin，AMO)，其他的二線抗生素如四環(huán)素、左氧氟沙星、慶大霉素等也常用于胃腸病的防治。

隨著抗生素在臨床治療中的廣泛應用，H.pylori的耐藥率逐年上升，根除H.pylori的難度逐年增加。目前，CLA的高耐藥率主要出現在歐美及亞洲發(fā)達地區(qū)［1］;MTZ 的高耐藥率(≥80)主要出現在非洲［2］，但很多地區(qū)高耐藥的MTZ在瑞典［3］能得到很好的治療效果;AMO的耐藥率在歐洲低于2%，在亞非拉國家為6% ～59%［4］。我國2005年所做的流行病學調查［5］顯示H.pylori對MTZ的耐藥率已超過70%，部分地區(qū)甚至達100%;對CLA的耐藥率也達到25%。故H.pylori對抗生素的耐藥存在顯著的地區(qū)差異。我省迄今尚缺乏H.pylori耐藥狀況的調查資料。本研究檢測了貴州地區(qū) H.pylori臨床菌株對 MTZ、AMO、CLA等多種抗生素的藥敏情況并分析耐藥患者的臨床特點，有助于了解貴州地區(qū)H.pylori對抗生素的耐藥現狀，指導貴州地區(qū)抗H.pylori的臨床治療，為貴州地區(qū)H.pylori臨床基礎綜合研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 30例臨床分離菌株來自2007年-2009年因上消化系癥狀就診于我院行胃鏡檢查的98例患者，男18例，女12例，年齡20～77歲，中位年齡48.77 歲。

1.2 儀器與設備 微需氧培養(yǎng)罐 (Mitsubishi，Japan);恒溫培養(yǎng)箱;微需氧產氣袋 (850 mL/L N2，100 mL/L CO2，50 mL/L O2)(Mitsubishi，Japan);尿素酶試紙(天和微生物試劑有限公司，杭州);AMO、CLA、MTZ E-test藥敏試紙(AB BIODISK，瑞典);Kirby-Bauer藥敏紙片，包括:CLA、AMO、左氧氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢呋肟、復方新諾明(天和微生物試劑有限公司，杭州)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集、生化鑒定、標本轉運、接種、培養(yǎng)、陽性鑒定:參見胡林等［6］的《貴州省幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養(yǎng)》。

1.3.2 Kirby-Bauer紙片擴散法及 E-test藥敏試驗:Kirby-Bauer紙片擴散法:抗生素敏感性的判定參照中國藥品生物制品鑒定所制定的抗菌藥藥敏試驗判定標準，抑菌環(huán)直徑＜7 mm判定為耐藥。E-test藥敏試驗:記錄MIC，耐藥測定范圍為0.016～256 mg/L。

1.3.3 抗生素耐藥率的檢測及耐藥患者臨床特征的采集:以E-test檢測的MTZ、CLA、AMO敏感患者為對照，分別分析上述三種抗生素耐藥患者近期用藥史、上消化道疾患病種、性別、年齡等方面的特征。

1.4 統(tǒng)計學處理 數據使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Kirby-Bauer 紙片擴散法檢測 CLA、AMO、左氧氟沙星、慶大霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為30.00%、20.00%、3.33%、13.33%、6.67%，頭孢呋肟和復方新諾明未見耐藥菌株。CLA的耐藥率較左氧氟沙星和四環(huán)素的耐藥率高(P＜0.05)，AMO的耐藥率較左氧氟沙星的耐藥率高(P＜0.05)，其他抗生素之間的耐藥率比較無顯著性差異(見圖1)。

圖1 Kirby-Bauer紙片擴散法檢測貴州地區(qū)H.pylori對不同抗生素的耐藥現狀Fig 1 Resistant rates of H.pylori to different antibiotics by Kirby-Bauer disk diffusion test in Guizhou province

2.2 E-test試驗檢測 MTZ、CLA、AMO的耐藥率分別為 63.33%、33.33%、26.67%。MTZ 的耐藥率比AMO和CLA的耐藥率明顯較高(63.33%vs 33.33%、26.67%，P＜0.05)，AMO 和 CLA 的耐藥率無明顯差異(33.33%vs 26.67%，P ＞0.05，見表1)。

Kirby-Bauer紙片擴散法與E-test試驗結果對比，CLA的耐藥率分別為 30.00%(9/30)和 33.33%(10/30)，AMO的耐藥率分別為 20.00%(6/30)和26.67%(8/30)，兩種方法檢測的耐藥率均無顯著性差異(P值分別為0.781和0.542)。

2.3 耐藥患者的上消化道疾患特征 消化性潰瘍患者MTZ耐藥率較慢性胃炎伴糜爛患者的耐藥率高(84.62%vs 27.27%，P ＜0.05)。十二指腸炎、慢性胃炎伴糜爛、消化性潰瘍患者對CLA和AMO的耐藥率無明顯差異 (見表2)。

2.4 耐藥患者的性別特征 MTZ、AMO、CLA的耐藥情況在男性、女性之間進行比較，結果發(fā)現男性患者對MTZ的耐藥率較女性患者對MTZ的耐藥率高(77.7%vs 41.67%，P＜0.05)，兩組對CLA和AMO的耐藥率無明顯差異 (見表3)。

2.5 耐藥患者的年齡特征 30～60歲年齡組對MTZ的耐藥率比其他年齡組對MTZ的耐藥率高(83.33%、20.00%、42.86%，P ＜ 0.05)，各年齡組對 CLA 和AMO的耐藥率相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表4)。

表2 貴州地區(qū)H.pylori對抗生素的耐藥情況與患者疾病的關系Tab 2 Relationship of resistant rates of H.pylori to antibiotics with different diseases in Guizhou province

表3 貴州地區(qū)H.pylori對抗生素的耐藥情況與患者性別的關系Tab 3 Relationship of resistant rates of H.pylori to antibiotics with gender in Guizhou province

表4 貴州地區(qū)H.pylori對抗生素的耐藥情況與各年齡組的關系Tab 4 Relationship of resistant rates of H.pylori to antibiotics with ages in Guizhou province

3 討論

研究顯示H.pylori對抗生素的耐藥率逐年增加，三聯療法的 H.pylori根除率已從20世紀90年代的90%降到目前的70%左右。地區(qū)性抗生素耐藥及敏感情況的調查，有助于了解當地 H.pylori耐藥率的變遷，從而指導地區(qū)抗生素的使用。本研究首次從我省上消化道疾病患者胃黏膜中成功分離培養(yǎng)H.pylori臨床菌株30例，經藥敏法檢測我省H.pylori臨床菌株對抗生素的耐藥現狀。

隨著對H.pylori檢測技術的開展，已經開發(fā)出多種對H.pylori耐藥的檢測方法。不同的藥敏實驗方法和實驗條件會得到不同的藥敏實驗結果，紙片擴散法(Kirby-Bauer test)和 E 試驗法(E-test)［7］是目前公認的體外抗菌藥物敏感試驗。Kirby-Bauer test簡單易行、價格便宜、藥物選擇靈活，適用于對生長快的細菌進行藥敏試驗，廣泛用于體外藥敏實驗的研究。但Kirby-Bauer test的結果缺乏定量的判斷標準，不能準確檢測藥物的MIC。E-test操作簡單、定量檢測、MIC結果直觀準確、可直接讀取、重復性好，缺點是試紙價格昂貴。為評價兩者在研究H.pylori耐藥性的價值和臨床適用性，比較其結果差異顯著性，為臨床研究提供依據，本研究針對常用的抗生素CLA、AMO，采用Kirby-Bauer test和E-test兩種方法進行了耐藥性對比分析。結果顯示，Kirby-Bauer test和E-test檢測CLA的耐藥率分別為30.00%、33.33%，檢測AMO的耐藥率分別為20.00%、26.67%。兩種方法的統(tǒng)計結果比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，故經濟實惠的Kirby-Bauer test檢測結果也可以作為臨床檢測H.pylori耐藥的有效方法。

MTZ屬于硝基咪唑類衍生物，具有高效、廣譜的殺菌作用，其作用不受胃酸影響，價格低廉，因此在發(fā)展中國家成為治療 H.pylori感染的首選藥物。H.pylori對MTZ的耐藥性是全球性的，在世界范圍內，主要體現為發(fā)展中國家顯著高于發(fā)達國家;H.pylori對MTZ的耐藥性有逐年升高的趨勢，北京地區(qū) H.pylori對MTZ的耐藥情況從1999年的36.3%上升到2005年的79.2%［8］。本研究顯示貴州地區(qū) MTZ的耐藥率目前高達63.33%，與我國其他地區(qū)一樣處于較高水平。

CLA是新一代大環(huán)內酯類藥物，在胃內低pH值環(huán)境下仍有較好的穩(wěn)定性和殺菌作用。不同國家不同地區(qū)的耐藥情況存在差異。近期資料顯示，在亞洲及經濟較落后地區(qū)耐藥率低，而在發(fā)達地區(qū)耐藥率均高達20%［1］。本研究顯示貴州地區(qū) H.pylori對CLA的耐藥率為33.33%，與其他地區(qū)相比較，處于較高水平。AMO是臨床常用藥物，H.pylori對其不易產生耐藥性，一直以來都作為抗H.pylori的首選藥物之一，可能與其耐藥性并非由內酰胺酶基因介導有關，但近年來耐藥菌株也逐漸增多［9］。本研究顯示貴州地區(qū)H.pylori對AMO的耐藥率為26.67%，應當引起臨床工作者的重視。

由于一線抗生素耐藥情況的惡化，臨床上針對耐藥患者可推薦使用左氧氟沙星、四環(huán)素、慶大霉素等二線治療，但隨著這些藥物在臨床上逐漸普及使用，耐藥問題也凸顯出來。我們的研究顯示貴州地區(qū)對二線抗生素左氧氟沙星、四環(huán)素、慶大霉素的耐藥率分別為3.33%、6.67%、13.33%，情況較發(fā)達地區(qū)樂觀。為了進一步拓寬貴州地區(qū)抗 H.pylori治療的選擇，我們增加了頭孢呋肟和復方新諾明。頭孢呋肟與AMO同屬于β-內酰胺類藥物，可廣泛作用于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，對范圍廣泛的常見病原菌均有殺菌活性，對許多AMO耐藥的菌株都有效;后者由于價格低廉，在貴州地區(qū)仍然廣泛用于感染的治療。本研究顯示頭孢呋肟、復方新諾明對 H.pylori菌株的耐藥率均為0、0。

為了臨床治療的有效性，我們進一步分析了抗生素耐藥菌株與臨床疾病的相關性。消化性潰瘍患者對MTZ的耐藥率較慢性胃炎伴糜爛患者的耐藥率更高(84.62%vs 27.27%，P ＜0.05)，可能與消化性潰瘍患者臨床癥狀較慢性胃炎重，服用藥物種類多、量多、時間長從而導致產生繼發(fā)性耐藥有關;既往報道H.pylori對MTZ的耐藥率女性高于男性［10］，認為可能與該藥較廣泛用于婦科疾病和口腔科疾病治療、致細菌的硝基還原酶rdxA及frxa基因突變有關，我們的研究顯示貴州地區(qū)男性患者對MTZ的耐藥率較女性患者高;耐藥患者的性別研究顯示30～60歲年齡組對MTZ的耐藥率與20～30歲組和60～80歲組相比顯著較高(P＜0.05)，研究結果和國內外報道基本一致。遺憾的是，對CLA和AMO耐藥患者，不論疾病種類，還是性別、年齡與敏感組相比較，均未發(fā)現特征性變化。

綜上所述，針對貴州地區(qū)的H.pylori耐藥現狀，我們提出以下建議:(1)本研究提示貴州地區(qū)MTZ的耐藥率高達63.33%，故我們推薦不要把MTZ作為首選的抗H.pylori治療藥物，尤其是男性消化性潰瘍患者應避免選用MTZ;(2)CLA可作為首選的抗 H.pylori治療藥物，但需警惕其耐藥性的存在，對復治或難治患者，不宜作為首選;(3)AMO、左氧氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢呋肟、復方新諾明耐藥率均較低，均可作為貴州地區(qū)抗H.pylori治療的較好選擇，但需警惕其超敏反應和毒副作用;(4)針對日益嚴重的抗生素耐藥情況，部分患者必要時可通過經濟實惠的紙片擴散法選擇敏感性強的抗生素治療;(5)臨床工作者需高度重視愈演愈烈的 H.pylori抗生素耐藥情況，臨床上應嚴格重視抗 H.pylori的適應證。

總之，本研究在我省首次進行 H.pylori耐藥狀況的流行病學調查，對本地區(qū)常用抗生素耐藥率有了初步了解。我們還需要對本地區(qū)H.pylori對抗生素的耐藥性進行持續(xù)和更廣泛的監(jiān)測。

［1］ De Francesco V，Zullo A，Ierardi E，et al.Phenotypic and genotypic Helicobacter pylori clarithromycin resistance and therapeutic outcome:benefits and limits［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65(2):327-332.

［2］ Seck A，Mbengue M，Gassama-Sow A，et al.Antibiotic susceptibility of Helicobacter pylori isolates in Dakar，Senegal［J］.J Infect Dev Ctries，2009，3(2):137-140.

［3］ L?fmark S，Edlund C，Nord CE.Metronidazole is still the drug of choice for treatment of anaerobic infections ［J］.Clin Infect Dis，2010，50(1):S16-23.

［4］ Boyanova L，Mitov I.Geographic map and evolution of primary Helicobacter pylori resistance to antibacterial agents［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2010，8(1):59-70.

［5］ Hu PJ，Hu FL.Summary of the 4th national congress conference of Helicobacter pylori of Chinese medical association［J］.Clin J Dig，2005，25:698-699.

胡品津，胡伏蓮.中華醫(yī)學會第四次全國幽門螺桿菌學術會議紀要［J］.中華消化雜志，2005，25:698-699.

［6］ Hu L，Liu L，Tan QH，et al.Isolation and culture of clinical strains of Helicobacter pylori from patients in Guizhou Province［J］.World Chin J of Dig，2009，17(27):2830-2834.

胡林，劉苓，譚慶華，等.貴州省幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養(yǎng)［J］.世界華人消化雜志，2009，17(27):2830-2834.

［7］ Best LM，Haldane DJ，Keelan M，et al.Multilaboratory comparison of proficiencies in susceptibility testing of Helicobacter pylori and correlation between agar dilution and E testMethods［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47(10):3138-3144.

［8］ Cheng H，Hu FL.The epidemiology of Helicobacter pylori resistance to antibiotics in Beijing［J］.Natl Med J China，2005，85(39):2754-2757.

成虹，胡伏蓮.北京地區(qū)幽門螺桿菌耐藥情況及其耐藥趨勢［J］.中華醫(yī)學雜志，2005，85(39):2754-2757.

［9］ Watanabe K，Tanaka A，Imase K，et al.Amoxicillin resistance in Helicobacter pylori:studies from Tokyo，Japan from 1985 to 2003 ［J］.Helicobacter，2005，10(1):4-11.

［10］ Glupczynski Y，Mégraud F，Lopez-Brea M，et al.European multicentre survey of in vitro antimicrobial resistance in Helicobacter pylori［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2001，20(11):820-823.

Antibiotic resistance of Helicobacter pylori in Guizhou Province

LIU Ling1，HU Lin1，LIU Yalin1，ZHOU Li1，CHE Zhuping2，TAN Qinghua2
1.Department of Gastroenterology;2.Department of Endoscopy，Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China

ObjectiveTo determine the Helicobacter pylori(H.pylori)resistance to multiple antibiotics and the clinical features of antibiotic-resistance patients.Methods30 H.pylori strains were successfully isolated.Resistance to different antibiotics，including clarithromycin(CLA)，amoxicillin(AMO)and metronidazole(MTZ)were determined by Kirby-Bauer and E-testMethods.Information of clinical features was gathered.ResultsKirby-BauerResultsshowed 20.00%，3.33%，13.33%，30.00%，6.67%，0，0 of the strains were resistant to AMO，levofloxcin，gentamicin，CLA，tetracycline，cefuroxime or SMZ-TMP respectively.E-testResultsmanifested that 63.33%，26.67%，33.33%of the strains were resistant to MTZ，AMO or CLA respectively.The resistance rate of H.pylori to MTZ in male patients(77.78%)was higher than that in female patients(41.67%)(P ＜0.05).The resistance rate of H.pylori to MTZ in patients with peptic ulcer(84.62%)was higher than that in patients with erosive gastritis(27.27%)(P ＜0.05).Patients aged 30～60 years old had a higher resistance rate to MTZ than other groups(P ＞0.05).There was no significant difference in CLA and AMO resistance rate among sex ages or disease.ConclusionResistance of H.pylori to antibodies should be pay more concern in Guizhou province.Resistant rate of H.pylori to MTZ is the highest compared with other antibodies，especially in male patients with peptic ulcer around 30 ～60 ages.

Helicobacter pylori;Antibiotic resistance

R57

A

1006-5709(2012)08-0702-04

2012-02-07

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.005

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金項目，黔省專合字(2008)94號

劉苓，醫(yī)學博士，主要從事幽門螺桿菌及腸黏膜免疫研究。E-mail:lingzipurple@163.com