一氧化氮和一氧化氮合酶在大鼠腦損傷組織中的表達

顱腦損傷患者早期死亡常常取決于原發性腦損傷及繼發性損傷的程度。及時適當的治療，可以減輕和避免腦損傷后某些繼發性病理改變，提高療效，改善預后。Graham等發現創傷性腦損傷死亡患者的90％有缺血性改變，是繼發性損傷的主要機制。近年來，一氧化氮（nitric oxide，NO）［1］在急性腦缺血損傷中的作用日益受到人們的關注。NO是目前公認的一種信息傳遞分子［2］，在創傷性腦損傷（TBI）中，具有興奮性氨基酸和產生氧自由基的作用，業已證明NO參與腦缺血過程中N－甲基－D天門冬氨酸（NMDA）調節的神經毒性和氧自由基損傷［3］。本文旨在研究 TBI后 NO與NOS（nitrie oxide synthase，NOS）在腦組織中的變化及意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 Sprague-Dawley大鼠52只，雌雄不限，體質量（300±50）g，由南通大學實驗動物中心提供。36只Sprague-Dawley大鼠隨機分為正常對照組（n＝6）和手術組（n＝30），手術組按受傷到處死的不同時間（6、24、72、120、168 h）分成 5 個亞組，每亞組6只。上述各組行腦組織勻漿NO、NOS檢測及腦組織含水量測定。剩余16只，分為4組，正常對照組4只，傷后6、72、168 h各4只，行組織病理切片檢查。

1.2 顱腦損傷動物模型制備 參照 Feeney′s［8］自由落體撞擊傷方法。SD大鼠稱重后經2％戊巴比妥鈉50 mg／kg腹腔注射麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上，頭部剃毛。消毒后于矢狀中線切開頭皮，分離骨膜，暴露前囟、冠狀縫及頂骨，以前囟后3 mm，向右旁開矢狀縫3 mm為中心作一直徑為4～5 mm顱骨鉆孔。保持硬腦膜不受損傷。將自由落體裝置底座置于右頂骨窗部的硬腦膜表面，以40 g砝碼樣重物自25 cm高沿套管下落打擊致傷底座（直徑 3.6 mm，最大下陷距離 3.2 mm）造成右頂局限性損傷。假手術組僅作頭皮切口，開顱骨窗，不致腦損傷。

1.3 NO含量、NOS活力及腦組織水含量的測定

預定時間予2％戊巴比妥鈉50 mg／kg腹腔注射麻醉以直血管鉗從兩側眶部穿通，向腹側彎曲，折斷顱骨，后咬除顱骨，迅速活殺斷頭處死大鼠，快速取腦。在左頂挫裂傷臨近皮層取約250 mg及150 mg腦組織各一份。前者用于腦組織含水量測定，后者用于NO含量及NOS活力測定，250 mg左右的腦皮層組織經電子分析天平稱重后置入預稱重的小瓷坩鍋中，恒溫干烤箱110℃烘烤 24 h，烤至恒重（兩次稱重差別≤0.2 mg），按Elliott公式計算腦組織水含量：腦含水量（％）＝（濕重－干重）／濕重 ×100％。4只空瓷坩堝經同樣干燥方法，稱取質量計算稱樣修正誤差。150 mg腦組織標本均置于－20℃低溫冰箱中待生化測定。

1.4 組織病理學檢查 動物予以深度麻醉后開胸，以100 mL冷生理鹽水經左心室主動脈灌注沖洗，然后以含4％多聚甲醛的0.1 mol／L PB液（pH 7.2）灌注固定，取腦。同液中固定4 h后置入含20％的蔗糖的0.1 mol／L PB液中4℃過夜。待組織下沉后取出，恒冷冰凍切片機做冠狀切片，切片自損傷前緣起，至后緣結束，片厚40 μm。冰凍切片行NADPHd組化染色。NADPHd組化染色步驟如下：切片收集于 0.01 mol／L PBS（pH 7.2～7.4）在中，經PBS漂洗3次，然后將切片置于NADPHd底物反應液中37℃孵育45 min。反應液為含 0.3％TritonX-100、0.2 mg／mL 硝基四氮唑藍（NBT）和 β-NADPHd（購自 Boehinger Mannheim 公司）的 0.01 mol／L PBS（pH 7.2－7.4）。反應后將切片移入 0.01 mol／L PBS漂洗。常規裱片、脫水、透明、中性樹脂封片。切片采用Olympus光學顯微鏡觀察，做進一步定性分析。強反應陽性細胞：胞漿著色濃密，呈藍黑色；相應核空白區變小，甚至消失；該類陽性細胞突起亦呈強陽性反應。中等強度反應陽性細胞：胞漿含藍色顆粒，顆粒不聚集成團塊；核空白區存在，為正常大??；細胞突起著色稍淡。弱反應陽性細胞：胞漿稀疏散在細小藍色顆粒；核空白區明顯，為正常大??；未見突起著色。

1.5 統計學方法 計量資料數據用x±s表示，采用SPSS軟件進行方差分析，組間兩兩比較采用g檢驗。檢測水準α＝0.05。

2 結果

2.1 TBI后腦組織NO含量、NOS活力變化 見表1。由表1顯示TBI后腦組織中NO含量、NOS活力在傷后6 h即有升高，72 h明顯升高，后雖有下降，但一直處于較高水平。對表1數據進行方差分析顯示各組NO含量與對照組比較有明顯差異（F ＝468.89，P＜0.05），組間比較顯示，各組間兩兩比較均有統計學意義（P＜0.05）。同時對表數據進行方差分析顯示各組NOS活力與對照組比較有明顯差異（F ＝84.32，P＜0.05），組間比較顯示，各組間兩兩比較均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 TBI后腦組織含水量變化 表1顯示TBI后腦組織含水量在傷后6 h即有升高，72 h明顯升高，后雖有下降，但一直處于較高水平。對表1數據進行方差分析顯示各組腦組織含水量與對照組比較均有明顯差異（F ＝1963.51，P＜0.05），組間比較顯示，各組間兩兩比較均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 皮層及腦底NOS陽性神經細胞及神經纖維的變化 在TBI后腦內NADPHd染色NOS陽性細胞展示不同的反應強度。在皮層主要可見散在分布的多極強反應陽性神經元。在陽性細胞周圍，分別見到數量不等的NADPHd陽性反應纖維，追蹤來源，觀察到除少量陽性纖維起源于強反應陽性細胞外，大部分纖維未見連于陽性細胞的胞體。損傷組6 h后傷灶部位NOS細胞明顯增多，主要是一些中等強度反應細胞，腦底出現了強反應陽性神經元，并有濃染粗大的NOS纖維束，病變持續，在168 h有所減弱，正常對照組中NOS陽性細胞及陽性纖維顯著少于其他各組（1－8圖中均為NADPHd組化染色 ×25）。

表1 腦損傷后腦組織NO含量、NOS活力、腦組織含水量的變化

圖2 正常大鼠腦底少量NOS弱陽性反應神經細胞

圖3 大鼠TBI 6 h后皮層較多NOS強陽性反應神經細胞，陽性神經纖維束

圖4 大鼠TBI 6 h后腦底較多濃染NOS強陽性反應神經細胞群、染色塊及陽性纖維束

圖5 大鼠TBI后72 h皮層較多NOS強陽性反應神經細胞及陽性纖維束

圖6 大鼠TBI后72 h腦底較多NOS強陽性反應神經細胞群、染色塊及成束的陽性纖維

圖7 大鼠TBI 168 h皮層NOS中等程度陽性反應神經細胞及陽性纖維

圖8 大鼠TBI 168 h后腦底NOS強陽性反應神經細胞、染色塊及陽性纖維束

3 討論

由于NO化學性質活潑，因而其合成酶一氧化氮合成酶，成為近年研究的熱點。生物體內NO是由左旋精氨酸（L-argininine，L-Ary）在 NOS的作用下合成。NO以相對特異的方式參與多種細胞及組織的生理病理過程，是一種相對穩定的通過細胞膜擴散的氣體自由基，具有抑制血小板聚集（PA）、抑制血管平滑肌細胞（VSMC）、抑制血小板激活因子（PAF）、誘導中性粒細胞－內皮細胞相互作用、調節血管張力、穩定循環容積、介導細胞免疫和細胞毒等作用［5］。NO在NOS的催化下合成，其半衰期很短，NO的量與NOS的表達有直接關聯，所以研究腦損傷腦缺血后NOS變化是間接了解NO變化的方法之一［6］。NO非經典神經遞質、細胞功能調節因子或信使，其在神經系統正常功能和疾病中，特別是在腦缺血中的作用日益受到重視。大腦某局部血流一旦中斷，就會因氧和能量供應停止而產生局灶性損傷。腦缺血時神經末梢釋放大量的谷氨酸，刺激NMDA受體引起Ca2＋內流，使細胞內Ca2＋濃度升高，達到一定濃度時，激活NOS活性，促進NO的產生，表現在腦缺血5～10 min，NO 突然升高，30 min 時達高峰。Tominage［7］等證實，再灌注時或腦缺血后期NO再度升高。研究資料表明，NO在腦缺血中有雙重作用［3］，腦缺血早期產生的NO可通過激活鳥苷酸環化酶使cGMP水平升高，擴張腦血管，從而增加缺血區腦血流，保護腦組織。即在腦缺血早期表現出保護作用，但NO濃度持續性增高可導致DNA和線粒體的功能損害［4，8］，后期表現為神經毒性作用［9］。而過量合成的NO也可通過超氧自由基反應，生成過氧亞硝酸根離子等造成腦神經細胞膜脂質過氧化，ATP酶活性降低，細胞蛋白質損傷，且能使各種含鐵硫的酶失活，從而阻斷細胞內能量合成及DNA復制，亦可通過影響細胞的線粒體功能實現其毒性作用。

NOS有3種亞型，即神經元型（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、內皮型（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、誘導型（inductional nitric oxide synthase，iNOS）。各型在腦組織中的分布以及在腦缺血中的作用各不相同。一般應用NADPHd組織化學方法研究NOS神經元的活性。NADPHd染色陽性神經元與腦組織內含NOS神經元分布一致。NADPHd組織化學方法在對神經元內的nNOS神經元定位、定性方面具有很強的一致性。即陽性神經員內含nNOS。NADPHd組織化學方法顯示NOS活性原理是：NOS在激活過程中首先接受NADPHd傳遞的電子，使酶分子中的黃素腺嘌呤二核苷酸／黃素單核苷酸（FAD／FMN）還原NOS成還原型，在其他氣體如硝基四氮唑藍被還原成二甲替顆粒，再局部沉積，通過觀察顆粒顏色深淺可判定NOS的活性。nNOS是鈣離子依賴酶，正常情況下，其活性較低，產生生理量的NO，起到細胞間信息傳遞作用。腦缺血后，其活性升高。其活性升高機制如下：大腦缺血后，細胞能量代謝障礙，細胞膜上Na＋-K＋-ATP酶活性受抑，細胞外鉀濃度升高，神經元細胞膜去極化，電壓依賴性鈣離子通道開放，細胞內鈣離子增多。谷氨酸釋放增加，重攝取減少，突觸間隙聚集大量谷氨酸，過度興奮NMDA受體，其調控的鈣通道開放，細胞外鈣離子大量內流。鈣離子與鈣調蛋白結合后使nNOS活性升高［9］，腦缺血后，ATP 產生減少，nNOS去磷酸化，故其活性增加。

本實驗表明：TBI后腦組織及血漿內NO含量、NOS活力即有升高，在傷后6 h即有升高，72 h明顯升高，后雖有下降，但在1周內處于較高水平。該實驗結果與Tominage［6］等的報道結果相吻合。但本實驗發現1周內NO含量、NOS活力持續升高，說明繼發性腦損害不僅在傷后存在，而且1周內持續存在。分析認為可能有以下幾點機制：①外傷后腦缺血，造成過度表達的NOS，引起過量的NO生成，其中NO含量及NOS活性以72 h較高，在其后雖有下降，但一直高于正常對照組。②腦水腫的繼發性改變與持續存在壓迫腦血管分支導致腦血供下降，使神經細胞供氧量下降，同時缺氧，神經細胞大量釋放谷氨酸，能激活NOS活性，促使NO含量升高?？梢詫е伦杂苫男纬桑鸺毎ねㄍ感陨?，加重腦水腫。本實驗證明了在腦組織中NO、NOS與腦水腫的程度變化趨勢一致。因此腦水腫與NO含量互為因果，提示在TBI后，檢測NO含量可以判斷腦水腫的程度。同時說明既然TBI后持續存在NO、NOS升高，那么NOS抑制劑的早期使用是必須的，而且用藥周期至少維持一周。同時，早期使用甘露醇解除腦水腫，也可以成為防治繼發性腦損害的重要措施。

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