慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬CA1神經(jīng)元突觸可塑性研究☆

海馬在學(xué)習(xí)記憶［1－3］、應(yīng)激調(diào)控中起關(guān)鍵作用［4－7］。有研究認(rèn)為海馬可能參與情緒的控制和反應(yīng)，其結(jié)構(gòu)損傷可能是抑郁癥患者情緒低落和學(xué)習(xí)記憶能力下降的基礎(chǔ)［8，9］。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究多集中在神經(jīng)系統(tǒng)功能可塑性方面，對(duì)神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性的研究較少［10－14］，且多處于神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)水平，尚未見到針對(duì)神經(jīng)信息傳遞最為關(guān)鍵的突觸結(jié)構(gòu)的研究［12，16］。本研究采用電鏡及圖像分析技術(shù)對(duì)CUMS大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行研究，力求從神經(jīng)元突觸角度為抑郁癥的神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性發(fā)病機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為30只健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，月齡 2～3個(gè)月，體重 180 g～220 g，首先用open-field實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，從中選擇評(píng)分相近的20只，將其置于安靜舒適實(shí)驗(yàn)環(huán)境單籠飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律光照，平均室溫（22±1）℃，空氣濕度50％～60％，并可自由進(jìn)食進(jìn)水。適應(yīng)飼養(yǎng)1周，每日觸摸使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作。1周后進(jìn)行隨機(jī)分組：對(duì)照組（即CON組，n＝10只）、抑郁癥組（即 CUMS組，n＝10只）。

1.2 慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激（ch ronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁模型的建立 本研究選用的應(yīng)激因子盡可能滿足慢性、輕度、不可預(yù)見性條件。實(shí)驗(yàn)大鼠持續(xù)28 d接受不同的應(yīng)激因子，包括群居飼養(yǎng)（5 只／籠）、通宵照明、40°鼠籠傾斜、潮濕墊料（300 mL純水浸濕墊料）、禁水后空瓶放置、頻閃光照（300flashes／min）及白噪音（80 db），實(shí)驗(yàn)過程中每天隨機(jī)給予一種刺激，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生。

1.3 糖水實(shí)驗(yàn) CUMS實(shí)驗(yàn)前、應(yīng)激第28 d在同等條件下進(jìn)行糖水實(shí)驗(yàn)和體重測(cè)量，時(shí)間均安排在早上8時(shí)進(jìn)行。記錄大鼠體重（g）、總液體消耗量（mL）、糖水消耗量（mL）、純水消耗量（mL），并計(jì)算糖水相對(duì)消耗量（mL／kg）、純水相對(duì)消耗量（mL／kg）及糖水偏好程度［糖水偏好程度＝糖水消耗量／總液體消耗量×100％］。糖水偏好用于評(píng)價(jià)快感缺乏程度，用糖水消耗量的下降來評(píng)定大鼠的抑郁程度。

1.4 open-field 實(shí)驗(yàn) CUMS應(yīng)激前及應(yīng)激第28 d進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)用于評(píng)定大鼠的探究活動(dòng)與情緒反應(yīng)。觀察的行為學(xué)指標(biāo)如下：①5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)總格子數(shù)目：包括中間格子數(shù)與周邊格子數(shù)，即四爪均進(jìn)入的方格方可計(jì)數(shù)；②5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)的周邊格子數(shù)目；③5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)的中間格子數(shù)目；④后肢直立次數(shù)：即兩前肢離地1 cm或攀爬內(nèi)壁即為站立1次；⑤第1分鐘內(nèi)運(yùn)動(dòng)格子的總數(shù)目；⑥修飾次數(shù)：即清潔理毛、洗臉、舔舐次數(shù)；⑦大便粒數(shù)。

1.5 處死時(shí)點(diǎn) 應(yīng)激前及應(yīng)激第28 d進(jìn)行行為測(cè)評(píng)后，每組各處死10只大鼠。

1.6 灌注、定位與取材 在選定的時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)確定將要處死的SD大鼠。麻醉后，經(jīng)心先用生理鹽水150 mL快速灌注，后用含戊二醛4％多聚甲醛250 mL先快后慢灌注固定。迅速取腦，先分離左右腦，并進(jìn)而分離出各側(cè)腦的研究腦區(qū)。分別對(duì)左右側(cè)的研究腦區(qū)置于2.5％戊二醛固定液中，待制備超薄電鏡切片。

1.7 電鏡標(biāo)本制作 多次漂洗組織塊，依次經(jīng)1％四氧化鋨后固定（2 h）、PBS漂洗3次、丙酮逐級(jí)脫水（50％、70％、90％、100％）、Epon812環(huán)氧樹脂包埋，修塊定位，UC6超薄切片機(jī)（R型）切片，片厚60 nm，撈片，用膠體金標(biāo)記技術(shù)（一抗為DA抗體）處理后，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色。

1.8 突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)測(cè)量 在日本日立公司電子顯微鏡（H7500）下放大20000倍并隨機(jī)攝片，用德國(guó)徠卡DM1000圖像分析軟件測(cè)量標(biāo)記陽性神經(jīng)元突觸的突觸界面曲率（參照J(rèn)ones等的方法）［17］、突觸活性區(qū)長(zhǎng)度與突觸后致密物厚度（參考 Guldner方法）［18］、突觸間隙寬度（用多點(diǎn)平均法測(cè)定）。測(cè)量示意圖見圖1及圖2。1.9 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行分析，糖水實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量方差分析（a repeated measurement ANOVA），組間比較使用單因素方差分析。open-field實(shí)驗(yàn)使用non-parametric Friedman ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組之間檢驗(yàn)使用Student’s ttest。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 突觸界面曲率測(cè)量示意圖（引自Jones）A.正向彎曲型突觸（即突觸后膜向前膜嵌人）B.平直型突觸C.負(fù)向彎曲型突觸（即突觸前膜向后膜嵌人）

圖2 突觸活性區(qū)長(zhǎng)度及突觸后致密物厚度測(cè)量示意圖（引自Guldner）PD＝突觸后致密物厚度（PSD）L＝突觸活性區(qū)長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 慢性輕度不可預(yù)見性的應(yīng)激對(duì)大鼠液體消耗量的影響 應(yīng)激前兩組大鼠總液體消耗、糖水消耗、純水消耗的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CUMS組大鼠應(yīng)激 28 d 后總液體消耗、糖水消耗均低于正常對(duì)照組，差異有顯著性（F＝40.29，P＜0.05；F ＝42.11，P＜0.05）。純水消耗兩組之間比較未見顯著差異（F ＝0.882，P＞0.05），見表1。

2.2 慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激對(duì)大鼠行為的影響

應(yīng)激28 d時(shí)，CUMS組大鼠5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)總格子數(shù)目及5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)的周邊格子數(shù)目與CON組大鼠相比無顯著性差異，但是CUMS組第一分鐘內(nèi)運(yùn)動(dòng)格子的總數(shù)目顯著多于CON組（χ2＝7.6，P＜0.05），CUMS組大鼠5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)的中間格子數(shù)目及后肢直立次數(shù)比 CON組大鼠減少（χ2＝9.1，P＜0.05；χ2＝5.9，P＜0.05），修飾次數(shù)及大便粒數(shù)明顯增多（χ2＝7.3，P＜0.05；χ2＝5.9，P＜0.05）。CUMS大鼠應(yīng)激前與應(yīng)激28 d時(shí)，在5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)的中間格子數(shù)目、第1 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)格子的數(shù)目、后肢直立次數(shù)、修飾次數(shù)、大便粒數(shù)均有差異（均P＜0.05）。

表1 慢性應(yīng)激對(duì)大鼠液體消耗的影響

表2 慢性應(yīng)激對(duì)大鼠行為的影響

2.2 慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸界面結(jié)構(gòu)的影響 電鏡觀察顯示，CON組突觸數(shù)目較多，突觸小泡較多，突觸后致密物密度高，活性區(qū)較長(zhǎng)。CUMS組突觸相對(duì)數(shù)目較少，突觸小泡量少，突觸后致密物密度低，活性區(qū)長(zhǎng)度短。見圖1及圖2。

圖1 CON組大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)（×20000）

圖2 CUMS組大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)（×20000）

兩組大鼠海馬CAI區(qū)神經(jīng)元突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)測(cè)量結(jié)果顯示，CUMS組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸活性區(qū)長(zhǎng)度及PSD厚度顯著小于CON組（t＝5.85，P＜0.05；t＝3.79，P＜0.05），突觸界面曲率和突觸間隙寬度與對(duì)照組之間的差異無顯著性（P＞0.05）。見表 3。

3 討論

神經(jīng)可塑性指神經(jīng)系統(tǒng)功能與結(jié)構(gòu)的可塑性，宏觀上表現(xiàn)為腦功能、行為表現(xiàn)及精神活動(dòng)改變，微觀上表現(xiàn)為神經(jīng)元突觸、神經(jīng)環(huán)路的微細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的變化。抑郁模型建立成功與否是本研究的關(guān)鍵，本研究選用目前國(guó)際上得到廣泛認(rèn)可的CUMS建模方法，通過模擬人類中慢性低水平應(yīng)激促發(fā)大鼠抑郁發(fā)生，CUMS中應(yīng)激因子的多變性、不可預(yù)見性是建模成功的關(guān)鍵。本研究嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，在建模后28 d對(duì)CUMS大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)CUMS組大鼠較正常對(duì)照組大鼠，糖水相對(duì)消耗量減少、糖水偏好程度顯著降低（P＜0.05），呈現(xiàn)出抑郁癥核心癥狀 “快感缺乏”，在open-field實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)、修飾、排便等多項(xiàng)行為學(xué)上的變化提示CUMS組大鼠具有運(yùn)動(dòng)、探索能力、社交活動(dòng)、攻擊行為的減少，以及對(duì)陌生環(huán)境興奮性減低、焦慮、恐懼等抑郁伴隨癥狀［19，20］，這均符合抑郁癥動(dòng)物模型建立的表面效度［21］。行為學(xué)測(cè)評(píng)顯示本模型動(dòng)物表現(xiàn)出的抑郁狀態(tài)與抑郁癥患者的臨床表現(xiàn)有較高程度的相似性，抑郁癥大鼠模型建立較為理想。

表3 兩組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的測(cè)量結(jié)果及比較

突觸是神經(jīng)元之間的連結(jié)，是神經(jīng)信息傳遞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，是神經(jīng)可塑性變化的敏感部位。突觸可塑性（synaptieplastieity）是指突觸在形態(tài)（突觸形態(tài)的改變以及新的突觸聯(lián)系的形成和傳遞功能的建立）和功能上（突觸的反復(fù)活動(dòng)引致突觸傳遞效率的改變）的改變［22－24］。突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)是反映突觸可塑性改變的敏感指標(biāo)，目前常用的為突觸界面曲率、突觸活性區(qū)長(zhǎng)度、突觸間隙寬度及突觸后致密物厚度等。突觸界面結(jié)構(gòu)與突觸功能狀態(tài)及神經(jīng)信息傳遞有重要聯(lián)系［26，27］。突觸界面曲率、活性區(qū)長(zhǎng)度、PSD增厚減小及突觸間隙變寬可能是突觸傳遞功能降低的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［24－26］。本研究顯示，CUMS抑郁大鼠應(yīng)激28d后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸活性區(qū)長(zhǎng)度及PSD厚度顯著小于對(duì)照組，這提示在CUMS造模過程中大鼠海馬CA1腦區(qū)的神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了可塑性改變，而根據(jù)突觸結(jié)構(gòu)與神經(jīng)信息傳遞的重要聯(lián)系分析，這種突觸結(jié)構(gòu)可塑性的改變可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)信息傳遞功能的下降，從而引起認(rèn)知、情感等多方面的抑制，導(dǎo)致患者表現(xiàn)出抑郁癥的各種臨床癥狀。綜上所述，本研究顯示CUMS抑郁大鼠海馬CA1腦區(qū)的神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了可塑性改變，這種可塑性改變可能是抑郁癥發(fā)生的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，可能在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

本研究旨在從突觸角度驗(yàn)證抑郁癥的神經(jīng)可塑性假說，為以海馬神經(jīng)元再生為靶點(diǎn)的新型抗抑郁藥物的開發(fā)［27］提供理論依據(jù)。本研究作為系列研究的第一步，只評(píng)價(jià)了突觸結(jié)構(gòu)的改變，未對(duì)突觸結(jié)構(gòu)改變和特征性行為改變之間進(jìn)行相關(guān)性研究，有待在后續(xù)研究中完善，另外本研究只是單一時(shí)點(diǎn)研究（應(yīng)激開始后28 d），多時(shí)點(diǎn)（建模前后的 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)建模前、建模后 7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、56 d），多腦區(qū)（杏仁核、海馬各區(qū)等）與中樞神經(jīng)遞質(zhì)及藥物治療的相關(guān)性研究正在進(jìn)行中。

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