人類大鼠肉瘤蛋白同源蛋白和高遷移率族蛋白A1在垂體腺瘤中的表達與侵襲性的關系☆

垂體腺瘤屬顱內常見良性腫瘤，但約1／3的腫瘤呈侵襲性發展，可侵犯海綿竇、蝶竇、下丘腦等周圍組織結構，使得手術全切除困難，患者術后常需放射治療、藥物治療等綜合治療。盡管如此，侵襲性垂體腺瘤患者仍有較高的復發率。因此，探尋侵襲性垂體腺瘤的發病機制一直是研究的熱點。近年來，在研究腫瘤侵襲性行為相關的靶點中發現：HRAS和HMGA1在細胞內信號傳遞和細胞增殖過程中起著關鍵和核心作用，與腫瘤發生密切相關，同時可作為判斷腫瘤侵襲性程度的可靠生物學指標［1，2］。因此本研究將以 HRAS 和 HMGA1為研究靶點，檢測二者分別在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤中的表達情況，并探討二者與垂體腺瘤侵襲性行為發生的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年8月至2012年5月重慶醫科大學附屬第一醫院神經外科60例垂體腺瘤患者的術后組織標本（經患者知情同意后進行相關實驗），其中男25例，女35例，年齡16～72歲，平均年齡45.2歲。侵襲性垂體腺瘤的判斷標準：①本研究采用Wilson改良的Hardy分類法［3］將Ⅲ～Ⅳ級或C、D、E期的腫瘤歸為侵襲性腺瘤；②術前影像學改變，CT及MRI可見海綿竇、鞍旁及下丘腦等鄰近結構的破壞；③術中所取鞍底骨質或鄰近硬腦膜經病理學證實有腫瘤細胞侵犯；④術中見鞍底骨質及硬腦膜被侵襲破壞，腫瘤突入蝶竇腔或侵入鞍旁的血管神經。符合其中之一者即可確定為侵襲性垂體腺瘤。60例標本中，侵襲性垂體腺瘤病例標本28例，非侵襲性垂體腺瘤病例標本32例。所有病例術前有完善的影像學及內分泌檢查資料，術后經病理診斷確診。手術時取所需組織用生理鹽水洗凈積血，一部分置入4％多聚甲醛溶液內固定，一部分直接放入凍存管中，剩余一部分放入經焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理過的凍存管中，后兩者置入液氮備用。

1.2 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測HRAS和HMGA1 mRNA表達 按Trizol試劑（購于大連寶生物工程公司）說明書步驟提取總RNA，－80℃冰箱保存備用。提取的RNA含量通過752型紫外分光光度計測定260 nm吸收值，按每OD260相當 40 μg RNA 計算 RNA 的產率，OD260在1.8～2.0視為抽提的RNA純度很高。PCR引物由大連寶生物工程公司設計并合成。HRAS上游引物序列5-GCGATGACGGAATATAAGG-3，下游引物序列 5-ACTGGTGGATGTCCTCAA-3，產物長度 289 bp；HMGA1上游引物序列5-TCTCTGCTCCTTCACTGT-3，下游引物序列5-CTCCTGCCTTCCTGTAAC-3，產物長度 277 bp；β-actin上游引物序列5-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3，下游引物序列5-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3，產物長度594 bp；β-actin上游引物序列 5-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3，下游引物序列5-AAGGAAGGCT GGAAGAGT-3，產物長度172 bp。RT擴增條件：37℃15 min，85℃5 s；PCR擴增條件： 94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，循環 35次，72℃延伸 5 min。產物經2％瓊脂糖凝膠電泳分離；紫外燈下拍照，采用Quantity-one圖像分析軟件比較電泳條帶光密度值，獲得HRAS和HMGA1的相對表達量。

1.3 免疫組織化學 SABC法檢測 HRAS和HMGA1蛋白表達 標本經4％甲醛固定，常規石蠟包埋連續切片，HE染色和免疫組化染色。微波爐加熱修復，以3％H2O2溶液封閉內源性過氧化物酶，參照SP試劑盒（購置于北京中杉公司）產品說明書依次進行山羊血清封閉，以PBS代替一抗作陰性對照，一抗（HRAS和HMGA1單克隆抗體購置于美國ABCAM公司），4℃過夜，山羊抗兔二抗孵育，鏈霉素親生物素蛋白－過氧化酶孵育等處理。DAB（購置于北京中杉公司）顯色后，經蘇木素復染、鹽酸酒精分化，碳酸鋰返藍，酒精脫水、透明、中性樹膠封片后于顯微鏡下進行觀察。

根據IRS（immunoreactive score）半定量法計分：①染色深度，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②陽性細胞比例：在高倍（400×）鏡下隨機觀察5個視野，每個視野計數200個細胞，計算各視野中陽性細胞數的平均百分比，作為該切片的陽性細胞百分比。5％以下為0分，5％～25％為 1分，26％ ～50％為2分，51％～75％為3分，75％以上為4分。兩項計分結果相加，0分計為（－），1～ 2分計為（＋），3～ 6分計為（＋＋），6 分以上計為（＋＋＋）。

1.4 Western Blot法檢測 HRAS和 HMGA1蛋白表達 提取侵襲性及非侵襲性垂體腺瘤組織標本中的蛋白成分；BCA法測定蛋白濃度，加入樣品緩沖液，置于沸水浴中加熱5 min；制備15％的分離膠和5％濃縮膠；加樣電泳（濃縮膠80 V，30 min；分離膠 120 V，90 min）；電泳后濕轉至硝酸纖維素膜上（110 mA，150 min）；5％脫脂牛奶室溫封閉 2 h；5％脫脂牛奶稀釋一抗（1∶500～1∶1000），室溫孵育2～4 h或4℃過夜；5％脫脂牛奶稀釋二抗（1∶2000～ 4000），室溫孵育 1～2 h；TBST 洗膜 3次；顯影、定影。采用Image J分析軟件比較免疫印跡條帶灰度值。

1.5 統計學方法 采用PASW Statistics 18行兩獨立樣本 t檢驗、χ2檢驗，檢測水準 α ＝0.05。

2 結果

2.1 RT-PCR結果 HRAS在侵襲性垂體腺瘤中的 mRNA 表達（0.96±0.16），明顯高于其在非侵襲性垂體腺瘤中的表達（0.54±0.15），差別具有統計學意義（t＝10.437，P＜0.05），見圖 1；HMGA1在侵襲性垂體腺瘤中的mRNA表達（1.12±0.20），明顯高于其在非侵襲性垂體腺瘤中的表達（0.52±0.19），差別具有統計學意義（t＝11.742，P＜0.05），見圖 2。

2.2 免疫組織化學結果 HRAS陽性表達為垂體腺瘤細胞質內棕黃色顆粒，分布于淡藍色細胞核周圍。在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中HRAS的陽性表達率分別為22／28和15／32，兩組比較差異具有統計學意義（χ2＝6.35，P＜0.05）。HMGA1陽性表達可見細胞核內棕黃色顆粒，陰性表達者細胞核呈淡藍色。在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中 HMGA1的陽性表達率分別為 20／28和14／32，兩組比較差異具有統計學意義（χ2＝4.66，P＜0.05），見圖 3。

2.3 Western Blot結果 HRAS在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤組織中免疫印跡條帶灰度值分別是（1.25±0.16）、（0.76±0.10）（t＝14.848，P ＜0.05）；HMGA1在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤組織中免疫印跡條帶灰度值分別是（0.98±0.12）、（0.66±0.09）（t＝11.852，P＜0.05），見圖 4。

3 討論

圖1 RT-PCR檢測HRAS在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達。M：marker；1、2：侵襲性垂體腺瘤；3、4：非侵襲性垂體腺瘤

圖2 RT-PCR檢測HMGA1在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達。M：marker，1、2：侵襲性垂體腺瘤，3、4、5：非侵襲性垂體腺瘤

HRAS是RAS家族主要成員之一，它在細胞增殖、分化、凋亡等基本生理功能中起著重要作用。作為一個常見的癌基因，它參與了眾多腫瘤的發生。Yong［1］等對HRAS的分子結構功能進行研究發現，由166位至189位的氨基酸組成的高變區（HRV區），是引起人乳腺細胞侵襲性生長與發生遷移的結構基礎。而位于HRV區C-端的第173位和174位脯氨酸殘基，則是促成HRAS激活及促進人乳腺細胞侵襲性生長的關鍵。HRAS磷酸化激活下游信號分子也是導致腫瘤發生的常見機制。在HRAS誘導老鼠皮膚癌的模型中發現，凋亡相關基因PI3K的催化亞基p110α（由PIK3CA編碼）是RAS發揮關鍵作用的一個效應子［4］。HRAS誘導腫瘤細胞的侵襲性生長還與激活基質金屬蛋白酶家族中MMP-2和MMP-9成員有關［5－6］。基質金屬蛋白酶可通過降解基質膠原等結構蛋白成分，溶解破壞基底膜和細胞外基質，使腫瘤細胞向周圍組織浸潤。在本課題組前期的研究中發現MMP-2和MMP-9是促進侵襲性垂體腺瘤發生的重要原因［7－8］。在本研究中，HRAS在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤中的mRNA表達分別是（0.96±0.16）、（0.54±0.15）（P＜0.05），在組織中陽性表達率分別為22／28和15／32（P＜0.05），免疫印跡條帶灰度值分別是（1.25±0.16）、（0.76±0.10）（P＜0.05）。這些結果充分說明HRAS在侵襲性垂體腺瘤組織中的表達量顯著高于非侵襲垂體腺瘤組織。根據目前的研究，我們推測，HRAS表達升高可能引起基質金屬蛋白酶的分泌，從而使垂體腺瘤細胞外基質降解，參與其侵襲性行為的發生。我們先前的研究還發現自噬基因Beclin-1表達水平降低與垂體腺瘤侵襲性行為的發生密切相關，而HRAS能通過直接抑制自噬相關基因Beclin-1的表達，抑制自噬溶酶體的形成，引起細胞自噬性死亡水平降低，導致腫瘤惡性增殖［9－10］。

圖3 免疫組化檢測HRAS和HMGA1在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達。A：垂體腺瘤組織HE染色（400×）；B：垂體腺瘤組織陰性表達（400×）；C：侵襲性垂體腺瘤中HRAS陽性表達（400×）；D：非侵襲性垂體腺瘤 HRAS陽性表達（400×）；E：侵襲性垂體腺瘤中HMGA1陽性表達（400×）；非侵襲性垂體腺瘤HMGA1陽性表達（400×）

圖4 Western Blot檢測HRAS和HMGA1在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達。1、2為侵襲性垂體腺瘤；3、4為非侵襲性垂體腺瘤

高遷移率蛋白家族（HMG）是結構性轉錄因子，作為細胞核內非組蛋白，通過腺嘌呤－胸腺嘧啶結合元件同富含腺嘌呤－胸腺嘧啶的DNA鏈小溝結合。HMGA1是HMG家族成員之一，可調控多種基因轉錄進而參與腫瘤的形成和轉移［2］。研究發現，HMGA1抑制可維持上皮的極性和完整性并限制細胞增殖的E－鈣粘蛋白表達，E－鈣粘蛋白表達減少將導致腫瘤細胞間粘附力喪失，從而引起腫瘤發生侵襲及轉移。穩定轉染HMGA1基因的NIH3T3細胞克隆，細胞生長增殖速度加快，可誘導正常NIH3T3細胞惡性轉化［11］。在來源于低分化、轉移性的結腸癌細胞中，敲除HMGA1可明顯抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、腫瘤細胞的移植瘤形成及體內轉移［12］。同時，HMGA1是原癌基因HRAS的下游信號分子。Cleynent等［13］將原癌基因Ha-RASLeu61表達載體穩定轉染人胚胎腎HEK293細胞株后，qRT-PCR及Western Blot檢測到二者的表達均明顯升高。應用熒光素酶報告基因分析發現，在HMGA1啟動子區域有三個與HRAS致癌作用相關的調節區域，包括兩個近端區域（PRR1；－78／－24 bp），（PRR2；＋222／＋335 bp）及一個遠端區域（DRR；－1745／－1161 bp），而將含這些區域的 pIC（－1745／＋265）載體及 HRAS 共轉染到HEK293細胞后，HMGA1啟動子活性增加了15～20倍。在本實驗中，HMGA1在侵襲性、非侵襲性垂體腺瘤中的mRNA 表達分別是 1.12±0.20，0.52± 0.19（P＜0.05），在組織中陽性表達率分別為20／28和14／32（P＜0.05），免疫印跡條帶灰度值分別是 0.98±0.12，0.66±0.09（P＜0.05）。這些結果提示HMGA1在侵襲性組織中的表達量高于非侵襲性組織。另有研究發現，高水平表達的HMGA1與低水平表達的microRNA-296與前列腺癌的分級分期呈正相關，microRNA-296可促進HMGA1的降解及抑制其轉錄。給以外源性的microRNA-296可減少其表達水平，從而抑制前列腺癌的增殖及侵襲［14］。在我們前期基因芯片篩選侵襲性及非侵襲性垂體腺瘤差異表達的microRNA基礎上［15］，應用microRNA靶基因預測軟件Tartget Scan預測可調控 HMGA1的 microRNA，發現 microRNA-138不僅與垂體腺瘤侵襲性密切相關而且其機制可能與對HMGA1的負調控作用相關，但仍需后續實驗進一步證實。

綜上所述，本實驗研究結果提示HRAS、HMGA1的高表達與垂體腺瘤的侵襲性生長密切相關。本課題組前期已檢測到一些與垂體腺瘤侵襲性行為相關的靶基因，同時應用基因芯片完成了對侵襲性垂體腺瘤及非侵襲性垂體腺瘤中microRNA表達差異譜的篩選。在后期的實驗中，我們將從分子水平更深入研究microRNA對前期研究的靶基因的調控與垂體腺瘤侵襲性的關系，以期探討促進侵襲性垂體腺瘤發生的分子信號的相互作用機制，期待為垂體腺瘤找到有效的干預治療靶點。

［1］Yong HY，Hwang JS，Son H，et al.Identification of H-Rasspecific motif for the activation of invasive signaling program in human breast epithelial cells［J］.Neoplasia，2011，13（2）：98－107.

［2］Erasca E，Rnstighi A，Malngnamera R，et al.HMGA1 inhibits the function of p53 family members in thyroid cancer cells［J］.Cancer Res，2006，66（6）：2980－2989.

［3］Wilson CB.A decade of pituitary microsurgery： The Herbert o-Livercrona lecture［J］.Neurosurgery，1984，61（5）：814－833.

［4］Gupta S，Ramjaun AR，Haiko P，et al.Binding of RAS to phosph-oinositide 3-kinase p110alpha is required for RAS-driven tumorigenesis in mice［J］.Cell，2007，129（5）：957－968.

［5］Kim IY，Jeong SJ，Kim ES，et al.Type I collagen-induced pro-MMP-2 activation is differentially regulated by H-RAS and N-RAS in human breast epithelial cells［J］. J Biochemi Mol Biol，2007，40（5）：825－831.

［6］Lee KW，Kim MS，Kang NJ，et al.H-RAS selectively upregulates MMP-9 and COX-2 through activation of ERK1／2 and NF-KB：An implication for invasive phenotype in rat liver epithelial cells［J］.International Journal of Cancer，2006，119（8）：1767－1775.

［7］霍鋼，田加坤，唐文淵，等.MMP-2及 CD147在侵襲性垂體腺瘤中的表達及其相互關系的研究［J］.中國神經精神疾病雜志，2005，31（3）：168－171.

［8］李九州，霍鋼，鄭履平，等.MMP-9、HPA及CD34在侵襲性垂體腺瘤中表達的研究［J］.中國神經精神疾病雜志，2007，33（7）：404－407.

［9］馮清林，霍鋼，唐茂源，等.侵襲性垂體腺瘤中自噬相關基因Beclin1和MAPLC3的表達［J］.中國神經精神疾病雜志，2010，36（8）：476－479.

［10］Yoo BH，Wu X，Li Y，et al.Oncogenic RAS-induced downregulation of autophagy mediator beclin-1 is required for malignant transformation of intestinal epithelial cells［J］.J Biol Chem，2010，285（8）：5438－5449.

［11］張鑫，朱明光，袁紅艷，等.HMGA1基因轉染誘導NIH3T3細胞惡性轉化實驗研究［J］.中國免疫學雜志，2008，24（5）：390－393.

［12］Belton A，Gabrovsky A，Bae YK，et al.HMGA1 induces intestinal polyposis in transgenic mice and drives tumor progression and stem cell propertiesin colon cancer cells［J］.PLoS ONE，2012，7（1）：e30034.

［13］Cleynen I，Huysmans C，Sasazuki T，et al.Transcriptional control of the human high mobility group A1 gene：basal and oncogenic RAS-regulated expression［J］.Cancer Res，2007，67（10）：4620－4629.

［14］Wei JJ，Wu XY，Peng Y，et al.Regulation of HMGA1 expression by microRNA-296 affects prostate cancer growth and invasion ［J］.Clin Cancer Res，2011，17（6）：1297－1305.

［15］吳留洋，霍鋼，杜安東，等.miRNA在侵襲性垂體腺瘤中表達的初步研究［J］.中國神經精神疾病雜志，2011，37（12）：752－755.