靶向Xklp2靶蛋白和極光蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

細(xì)胞有絲分裂受多種蛋白調(diào)控，其中，靶向Xklp2靶蛋白（targeting protein for Xenopus kinesinlike protein 2，TPX2）是一個(gè)受細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控的核增殖蛋白，參與細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中紡錘體微管的組裝和調(diào)控［1－4］。極光蛋白（serine／threonineprotein kinase 6，Aurora-A）作為與中心體相關(guān)的原癌基因，主要參與細(xì)胞有絲分裂的調(diào)控，TPX2是Aurora-A靶向到紡錘體裝置所必需的。有證據(jù)表明［3］TPX2、Aurora-A 的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖。然而，TPX2和Aurora-A在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的變化及其與臨床病理特征的關(guān)系尚不明確，本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)50例手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織及10例正常腦組織標(biāo)本中TPX2和Aurora-A蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，探討TPX2和Aurora-A在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科2010年5月至2011年5月手術(shù)切除的50例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，10例對(duì)照腦組織取自因顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)者。標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。所有標(biāo)本經(jīng)病理科確診，術(shù)前均未行過(guò)放化療，有完整的臨床病理資料和隨訪資料。50例膠質(zhì)瘤患者中，男28例，女22例；年齡15～68歲，平均（34±4）歲。按WHO（2007年）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：Ⅱ級(jí)25例，Ⅲ級(jí)12例，Ⅳ級(jí)13例，其中Ⅱ級(jí)為低級(jí)別，Ⅲ－Ⅳ級(jí)為高級(jí)別。試劑：TPX2兔抗人單克隆抗體，于Bioworld technology公司購(gòu)買(mǎi)。Aurora-A單克隆抗體購(gòu)于Epitomics公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 Aurora-A和TPX2免疫組織化學(xué)染色方法

將術(shù)中所取膠質(zhì)瘤和正常腦組織標(biāo)本進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟、修復(fù)、分別加入一抗、二抗、三抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，在顯微鏡下觀察。其中TPX2與Aurora-A抗體稀釋倍數(shù)分別為1∶100和1∶100，二者修復(fù)條件均為枸櫞酸熱修復(fù)。用已知TPX2和Aurora-A陽(yáng)性的宮頸癌做陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 對(duì)二者的結(jié)果分析采用半定量分析方法，具體內(nèi)容參照文獻(xiàn)［5］對(duì)陽(yáng)性染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，即在高倍視野（400×）隨機(jī)選擇五個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以胞核及胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色著色為陽(yáng)性表達(dá)。著色評(píng)價(jià)如下：0分代表無(wú)染色；1分代表弱著色；2分代表輕度著色；3分代表重度著色。細(xì)胞評(píng)價(jià)如下：0分代表沒(méi)有腫瘤細(xì)胞；1分代表腫瘤細(xì)胞占0％～10％；2分代表腫瘤細(xì)胞占11％～50％；3分代表腫瘤細(xì)胞占50％以上。兩種得分相加介于0～1分為“－”；介于 2～3分為“＋”；4～5分為“＋＋”；6～9分為“＋＋＋”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，采用Spearman相關(guān)分析和卡方檢驗(yàn)，檢測(cè)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 Aurora-A在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) Aurora-A

在正常腦組織中未見(jiàn)表達(dá)（圖1A），在膠質(zhì)瘤組織中隨級(jí)別增高表達(dá)增高，陽(yáng)性物質(zhì)主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核，呈棕黃色（圖 1B，C，D）。Aurora-A在膠質(zhì)瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為56.0％（28／50），在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中（ Ⅲ－Ⅳ級(jí)）的表達(dá)水平（10／25）顯著高于低級(jí)別組（Ⅱ級(jí)，18／25）（χ2＝5.195，P ＝0.023）。

2.2 TPX2在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) TPX2在正常腦組織中未見(jiàn)表達(dá)（圖2A），在膠質(zhì)瘤組織中隨級(jí)別增高表達(dá)增高，陽(yáng)性物質(zhì)主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核，呈棕黃色（圖 2B，C，D）。TPX2在膠質(zhì)瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為 62.0％（31／50），在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中（Ⅲ－Ⅳ級(jí)）的表達(dá)水平（11／25）顯著高于低級(jí)別組（Ⅱ級(jí)，20／25）（χ2＝6.876，P ＝0.009）。

2.3 Aurora-A和 TPX2表達(dá)的相關(guān)性 表 1顯示，在膠質(zhì)瘤組織中TPX2、Aurora-A蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.521，P＜0.01）。

圖1 Aurora-a在腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)（SP×100；比例尺 20 μm）。A：正常腦組織中 Aurora-a表達(dá)；B：星形細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)中Aurora-a表達(dá)； C：星形細(xì)胞瘤Ⅲ級(jí)中Aurora-a表達(dá)；D：多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Ⅳ級(jí)中Aurora-a表達(dá)

圖2 TPX2在腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)（SP×100；比例尺20 μm）。A：正常腦組織中 TPX2表達(dá)；B：星形細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)中TPX2表達(dá)；C：星形細(xì)胞瘤Ⅲ級(jí)中TPX2表達(dá)；D：多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Ⅳ級(jí)中TPX2表達(dá)

表1 Aurora-A和Tpx2在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長(zhǎng)，膠質(zhì)瘤術(shù)后高復(fù)發(fā)率及其對(duì)放化療抵抗，給膠質(zhì)瘤的治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。腦膠質(zhì)瘤原核細(xì)胞通過(guò)有絲分裂進(jìn)行增殖，組織紡錘體和中心體在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要作用，它們作為細(xì)胞微管骨架，對(duì)細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞具有重要意義。蛋白激酶如Aurora-A、Polo和Neks激發(fā)并調(diào)控紡錘體和中心體復(fù)制、成熟和分裂［1－4］。Aurora-A作為Aurora激酶一種，與腫瘤的關(guān)系較為密切，有研究證實(shí)Aurora-A可以激發(fā)細(xì)胞分裂G2期的扳機(jī)點(diǎn)，使細(xì)胞更容易進(jìn)入分裂期，并參與中心體的合成及調(diào)控［6］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，Aurora-A 在乳腺癌［7］，卵巢癌［8］，食管癌［9］等腫瘤中存在過(guò)表達(dá)。探討其促進(jìn)腫瘤增殖及發(fā)生的原因除了與Aurora抑制抑癌基因P53因素外，還與Aurora-A和原癌基因c-Myc具有協(xié)同作用有關(guān)。因此，以Aurora-A為靶點(diǎn)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作為抗腫瘤治療的新思路，引起了研究者的關(guān)注。

TPX2是一種核增殖相關(guān)蛋白，是微管組裝、紡錘體形成的關(guān)鍵蛋白，參與有絲分裂期間紡錘體的形成并保持中心體完整。研究表明，TPX2具有高度的惡性生物學(xué)行為和促使細(xì)胞周期失調(diào)的功能，在多種惡性腫瘤如肺鱗狀細(xì)胞癌，唾液腺癌，卵巢癌中呈高表達(dá)［10－12］。TPX2 在紡錘體裝配調(diào)控中的功能需要Aurora-A共同參與發(fā)揮作用，TPX2、Aurora-A高表達(dá)與異倍體和基因組的不穩(wěn)定密切相關(guān)［13－14］，有證據(jù)表明 TPX2、Aurora-A 與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，而且二者間存在正相關(guān)［15－16］。

我們通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法對(duì)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中TPX2、Aurora-A表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Aurora-A在膠質(zhì)瘤組織中存在高表達(dá)，而正常腦組織中則檢測(cè)不到Aurora-A表達(dá)，尤其在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中更顯著，推測(cè)該基因有可能是惡性膠質(zhì)瘤的一個(gè)新的標(biāo)志物，或可作為分子治療的靶點(diǎn)；TPX2蛋白表達(dá)水平在腫瘤組織中明顯高于正常組織，而且隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)的增高，TPX2的表達(dá)水平越高，提示該蛋白與腦膠質(zhì)瘤的惡性增殖有關(guān)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出，在腦膠質(zhì)瘤組織中Aurora-A、TPX2的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，結(jié)合針對(duì)二者對(duì)體部腫瘤具有生長(zhǎng)增殖作用的上述報(bào)道［7－12］，我們推測(cè)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中，TPX2對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的有絲分裂期間紡錘體的形成并保持中心體完整性具有重要作用，而Aurora-A對(duì)TPX2復(fù)合體的形成具有促進(jìn)作用，二者在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程中可能起協(xié)同作用。

本研究通過(guò)免疫組化方法證實(shí)膠質(zhì)瘤組織中存在二者高表達(dá)這一現(xiàn)象，從而需要進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞功能試驗(yàn)明確兩者在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的作用。隨著對(duì)腫瘤基因治療的探索，在體部腫瘤中已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用基因敲除的方法實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，已經(jīng)取得階段性成功 ［17－19］。

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