切除卵巢對大鼠學習記憶和海馬雌激素受體α的影響及電針的干預作用

雌激素對中樞神經系統具有重要的保護作用，雌激素缺乏可造成認知功能障［1］。絕經后婦女用雌激素替代治療可提高絕經后婦女的認知和記憶能力［2］。但是有報道稱絕經后婦女長期使用雌激素替代治療有提高乳腺癌和子宮癌發病率的危險［3］。在臨床上，電針對治療老年婦女認知功能障礙有一定的療效［4］，但其作用機制尚不清楚。本實驗采用卵巢切除大鼠模型，造成認知功能障礙，觀察電針對去卵巢大鼠空間學習記憶及敏感腦區－海馬［5］雌激素受體 α（estrogen receptor alpha，ERα）表達的影響，探討電針改善絕經后婦女認知功能的機制，以期為臨床相關疾病的治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性SD大鼠40只，3月齡，體重160 g～200 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK（瀘）2007－0005。采用隨機數字法將大鼠隨機分成4組，每組10只：①電針組；②假電針組；③模型組；④假手術組。

1.2 認知功能障礙模型制備 所有大鼠均行10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL／100 g）。假手術組切除卵巢周圍脂肪，其余各組均實行雙側卵巢切除術。①組切除卵巢2周后予電針刺激，選穴方法按華興邦氏的方法實施，選取“足三里”“腎俞”兩穴，在不麻醉的狀態下采用一次性細美容針刺入穴位，雙側足三里穴接通韓氏電針儀，刺激參數：連續脈沖波，頻率3 Hz～4 Hz，強度4 mA～5 mA，以使大鼠后肢抖動為宜，在上午9時開始，每次20 min，隔日 1次，連續治療 3個月；②組針刺操作同①組，但不接通電針儀；③④組術后不予任何處理。

1.3 大鼠的學習記憶能力測試 各組在上述處理完成后進行Morris水迷宮測試。首先進行定位航行試驗：歷時4 d，每天上下午各2次，結果取4 d的平均值，將大鼠面向池壁，分別從4個入水點放入池中，記錄大鼠尋找到并爬上平臺所需時間即為逃避潛伏期時間，并記錄4 d的平均游泳距離和游泳速度。定位航行試驗后去除平臺行空間探索試驗：將大鼠任選一個入水點將大鼠放入池中，測定其在120 s內跨越平臺位置的次數。

1.4 大鼠海馬ERα表達水平的檢測 水迷宮測試后1周將大鼠用10％水合氯醛（0.3 mL／100 g）麻醉，頸總動脈取血，分離血清，－80℃低溫冰箱保存。在冰面上斷頭取腦，并迅速分離海馬組織，立即將海馬組織置液氮中，于－80℃低溫冰箱保存，待用于組織蛋白和mRNA的提取。

1.4.1 大鼠血清雌二醇（estradiol，E2）濃度的檢測 采用酶聯免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），最后統一檢測血清E2水平?？瞻卓准訕吮净驑藴势废♂屢?，其余相應孔中加標本或不同濃度標準品（100 μL／孔），36℃孵箱孵育90 min?？瞻卓准由锼鼗贵w稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液（100 μL／孔），36℃孵箱孵育60 min?？瞻卓准用附Y合物稀釋液，其余孔加入酶結合物工作液（100 μL／孔），36℃孵箱孵育 30 min。加入顯色底物 100 μL／孔，36℃孵箱孵育 15 min。加入終止液100 μL／孔，混勻后即刻測量450 nmOD值。

1.4.2 大鼠海馬 ERα蛋白表達的檢測 采用免疫印跡法（Western blot，WB）檢測，組織充分裂解，離心，分裝。配置蛋白標準液，測定并繪制標準曲線，制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，按恒流200 mA通電，電轉移100 min。加入封閉液和適量一抗抗體ERa（1∶400 Santa Cruz），搖床搖蕩孵育（4℃，過夜）。PBST漂洗濾膜，將膜與HRP結合的二抗（辣根過氧化酶標記抗體）用封閉液稀釋（1∶5000）室溫下搖蕩孵育2 h，然后用PBST充分洗膜。曝光、顯影、洗像。對各特異性蛋白條帶與相應的內參條帶進行灰度掃描，以兩者比值作為該蛋白合成的相對量。

表1 各組大鼠Morris水迷宮測試成績比較（±s，n＝10）

表1 各組大鼠Morris水迷宮測試成績比較（±s，n＝10）

注：1）與假電針組比較，經單因素方差分析P＜0.012）與模型組比較，經單因素方差分析P＜0.013）與假手術組比較，經單因素方差分析，P＜0.01

組別電針組假電針組模型組假手術組逃避潛伏期（s）18.02±4.791）2）33.61±5.622）3）42.95±4.053）18.08±4.28游泳距離（cm）361.25±35.871）2）693.22±42.552）3）930.15±38.613）395.75±30.26游泳速度（cm／s）20.55±3.24 19.97±2.69 19.85±3.52 21.79±3.44跨越平臺數（t）8.53±0.831）2）3.64±0.882）3）2.35±0.443）8.94±0.91

1.4.3 大鼠海馬ERαmRNA表達的檢測 采用實時熒光定量PCR（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測。取100mg海馬組織，用 Trizol法（Invitrogen Life Technologies）提取海馬組織總RNA，紫外分析及電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。逆轉錄按ReverTra Ace-α-逆轉錄試劑盒（TOYOBO）操作步驟進行。引物設計：由Invitrogen Biotechnology Co，LTD中國公司合成。ERa 上 游 引 物 ：5′-GTTTGCTCCTAACTTGCTCT TGG-3′，ERa下游引物 ：5′-CGGTGGATGTGGTCCTTCTCT-3′，擴增片段長度222 bp；內參β-actin上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，內參 β-actin 下游引物：5′-TA GGAGCCAGGGCA GTAATCT-3′，擴增片段長度110 bp。實時定量RTPCR反應按THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒（TOYOBO）操作步驟進行，結果處理采用 ΔΔCT法。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0進行統計學分析，計量資料用均數加減標準差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮法行為學檢測結果 與模型組比較，電針組和假電針組逃避潛伏期和游泳距離均明顯縮短（F ＝64.734，P＜0.01；F ＝563.857，P＜0.01），跨越平臺次數明顯增加（F ＝181.451，P＜0.01），且電針組改變更為明顯，與假手術組無顯著性差異（P＞0.05）。各組大鼠游泳速度無顯著性差異（F ＝0.122，P＞0.05）。見表 1。

2.2 電針對去卵巢大鼠血清E2，海馬區ERa蛋白和mRNA表達的影響 與模型組比較，電針組和假電針組大鼠血清E2水平顯著升高（F＝30.13，P＜0.01），但電針組升高更明顯。電針組ERa蛋白和mRNA相對表達量均顯著上升（F＝29.80，P＜0.01；F ＝96.19，P＜0.01），假電針組雖ERa蛋白和mRNA相對表達量較模型組有所上升，但仍與假手術組、電針組之間有差異（P＜0.01）。見圖 1、2，表 2。

圖1 各組大鼠海馬ERa蛋白表達

表2 各組大鼠血清E2濃度，海馬區ERa蛋白和mRNA表達比較（± s，n＝10）

表2 各組大鼠血清E2濃度，海馬區ERa蛋白和mRNA表達比較（± s，n＝10）

注：1）與假手術組比較，經單因素方差分析，P＜0.012）與模型組比較，經單因素方差分析，P＜0.013）與假電針組比較，經單因素方差分析，P＜0.01

組別電針組假電針組模型組假手術組ERa mRNA相對表達量1.410±0.0621）2）3）1.153±0.0351）1.037±1.0211）2.303±0.065血清E2濃度（pg／mL）56.47±6.701）2）3）49.29±5.901）2）38.16±5.441）65.13±7.72 ERa蛋白相對表達量0.796±0.0721）2）3）0.498±0.0631）0.406±0.0401）0.985±0.086

圖2 A：內參基因β-actin擴增曲線；B：內參基因β-actin溶解曲線；C：目的基因ERa擴增曲線；D：目的基因ERa溶解曲線。

3 討論

切除卵巢是一種較好的制備雌激素缺乏模型方法［6］。去卵巢大鼠模型不僅有類似絕經婦女雌激素水平的變化，而且出現相應的學習記憶功能障礙，是一種較好的研究絕經后中樞神經系統退行性變的模型，已被廣泛用于觀察體內雌激素減少對機體認知功能活動影響的實驗中［7］。故本實驗采用去卵巢大鼠動物模型，造成認知功能障礙。陳士鐸《辯證錄》中立有“呆病門”，分析其主要病機在于肝郁乘脾，胃衰痰生，積于胸中，彌漫心竅，使神明受累，髓減腦消而病。因此提出本病治療以健脾逐痰、健胃通氣為主要方法?！白闳铩睂僮汴柮魑附?，且為胃的下合穴，針之能健脾和胃，化痰理氣?！澳X為髓海”，腎藏精而生髓充腦，腦與腎關系最為密切，故選用腎的背俞穴“腎俞”補腎益髓，填精養神。

雌激素在特定腦區作用于學習或記憶，海馬結構是一個對多種刺激較為敏感的區域，同時還含有豐富的雌激素受體［8］。因此本試驗檢測ERa蛋白和基因表達的區域定位于對學習記憶關系最為密切的腦區—海馬。有報道稱雌激素下降使老年大鼠海馬樹突棘生長降低，這種下降與海馬突觸部位ERa丟失相關［9］。這激發了人們的猜測：ERa是雌激素調節老年大鼠海馬突觸發生的基礎，ERa是長期影響海馬突觸發生的主要受體。這些研究對在大腦發育中ERa表達的重要性提供了深遠的影響，同時對海馬發育中ERa表達對記憶、學習和激素調節的神經退化性疾病的影響具體重要的意義。

針刺治療認知功能障礙的Meta分析表明：國內針刺研究大部分未設立安慰性針刺對照組進行研究，這使試驗結果的客觀性缺乏更有理的說服力［10］。國外對針刺治療認知功能障礙有效性的看法不一致，有系統分析得出的結論是沒有足夠的證據支持針刺的有效性［11］。因此我們在試驗中特別設計了假電針組作為安慰性針刺對照組，從而更為客觀地研究電針對認知功能的影響。

本實驗采用Morris水迷宮測試、ELISA、Western blot以及實時熒光定量PCR的方法分別檢測了去卵巢大鼠行為學、血清E2濃度、ERa蛋白和基因表達的變化及電針對其的影響，結果顯示：Morris水迷宮測試中，各組大鼠游泳速度沒有明顯差異，可以排除因個體差異引起的不同。電針組與假電針組逃避潛伏期和游泳距離較模型組縮短，穿越平臺次數增加，且電針組改變更明顯。徐穎［12］等研究表明電針對記憶障礙大鼠行為學有改善作用，且電針治療后其逃避潛伏期尚優于正常對照組，本實驗與上述結果一致。這說明從行為學角度評價，電針可改善去卵巢大鼠的學習記憶能力，但電針改善認知功能障礙的作用機制尚不清楚，針刺是否具有與雌激素相同的增強記憶的功能？本研究對此進行了探討，研究結果顯示，電針組大鼠體內血清E2水平明顯高于模型組，說明電針能夠提高去卵巢大鼠體內雌激素水平。田淑君［13］等研究表明電針足三里穴可升高去卵巢大鼠體內雌激素水平，本研究與上述研究結果一致。本實驗還觀察到電針組與假電針組大鼠海馬ERa蛋白和mRNA表達水平與模型組相比亦明顯升高，因假電針也是對穴位的刺激，故假電針組大鼠的認知功能亦有相應改善，但電針組改變更明顯，排除了假電針的混雜影響。結合Morris水迷宮測試中行為學研究結果，提示電針對大鼠學習記憶的提高，可能是通過上調海馬ERa蛋白和基因表達來實現的，這與王偉［14］等觀察到的電針刺激足三里穴上調去卵巢大鼠海馬ERa mRNA表達的結果一致。值得注意的是，本實驗還采用Morris水迷宮測試研究了電針對去卵巢大鼠行為學的影響。結果提示卵巢切除后，電針足三里和腎俞穴能在蛋白和基因水平上調節ERa表達，這可能是針刺改善老年婦女認知功能障礙的機制之一。這些發現表明ERa確實參與學習記憶的過程，有助于進一步明確ERa在記憶過程中的作用。本研究也對癡呆病ERa的異常表達提供了一些證據，特別是阿爾茨海默氏病。

本研究表明，電針對大鼠腦海馬ERa蛋白和基因表達均有調整作用。而電針是如何影響海馬ERa的表達至今仍不明確，這可能和電針使體內雌激素的水平升高有關，也可能和電針對神經內分泌的整體調節有密切關系［15］。影響學習記憶的因素也不僅僅是ERa，值得關注的是已有研究者提出海馬星形膠質細胞的過度表達可能影響癡呆大鼠的學習記憶功能［16］。因此，電針作用于海馬ERa的詳細機制以及對學習記憶其它相關因素的研究是我們進一步研究的目標。

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