中國(guó)甜櫻桃病毒病及其檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

王文文 宗曉娟 陳立偉 王甲威 魏海蓉 徐麗 嚴(yán)雪瑞 劉慶忠

摘要：綜述了近年來(lái)中國(guó)對(duì)甜櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ Ｌ．）病毒病及其檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)報(bào)道，介紹了中國(guó)甜櫻桃上常見(jiàn)病毒的種類(lèi)、危害及特性，主要包括：李屬壞死環(huán)斑病毒（ＰＮＲＳＶ）、李矮縮病毒（ＰＤＶ）、蘋(píng)果褪綠葉斑病毒（ＡＣＬＳＶ）、櫻桃銼葉病毒（ＣＲＬＶ）、櫻桃病毒Ａ（ＣＶＡ）、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（ＣＧＲＭＶ）、櫻桃小果病毒（ＬＣｈＶ）；闡述了甜櫻桃病毒檢測(cè)中所用的方法、技術(shù)，包括指示植物法（生物學(xué)鑒定法）、電子顯微鏡技術(shù)、血清學(xué)方法、分子生物學(xué)技術(shù)方法等。

關(guān)鍵詞：甜櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ Ｌ．）；病毒；特性；檢測(cè)技術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ６６２．５；Ｓ４３６．６２９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）18－3929-05

Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｓｗｅｅｔ Ｃｈｅｒｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Cｈｉｎａ

ＷＡＮＧ Ｗｅｎ－ｗｅｎ１，ＺＯＮＧ Xｉａｏ－ｊｕａｎ２，３，ＣＨＥＮ Ｌｉ－ｗｅｉ１，ＷＡＮＧ Ｊｉａ－ｗｅｉ２，３，ＷＥＩ Ｈａｉ－ｒｏｎｇ２，３，ＸＵ Ｌｉ２，３，

ＹＡＮ Ｘｕｅ－ｒｕｉ１，ＬＩＵ Ｑｉｎｇ－ｚｈｏｎｇ２，３

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Sｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｏｍｏｌｏｇｙ， Ｔａｉａｎ ２７１０００，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ； ３． Ｓｈａｎｄｏｎｇ Kｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｏｍｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔａｉａｎ ２７１０００， Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ｒｅｃｅｎｔ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｓｗｅｅｔ ｃｈｅｒｒｙ ｉｎ Cｈｉｎａ was reviewed， ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｓｗｅｅｔ ｃｈｅｒｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ were introduced． Ｔｈｅｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｅｄ Ｐｒｕｎｕｓ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ， Ｐｒｕｎｕｓ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ， Ａｐｐｌｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ， Ｃｈｅｒｒｙ rａｓｐ lｅａｆ vｉｒｕｓ， Ｃｈｅｒｒｙ ｖｉｒｕｓ Ａ， Ｃｈｅｒｒｙ ｇｒｅｅｎ ｒｉｎｇ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，Ｌｉｔｔｌｅ ｃｈｅｒｒｙ ｖｉｒｕｓ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｐｌａｎｔ，ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｗｅｅｔ ｃｈｅｒｒｙ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ Ｌ．）； ｖｉｒｕｓ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

甜櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ Ｌ．）又名大櫻桃，屬薔薇科李屬櫻亞屬植物，原產(chǎn)于歐洲黑海沿岸和亞洲西部［１］，于２０世紀(jì)９０年代初引入中國(guó)，因其經(jīng)濟(jì)效益高、管理簡(jiǎn)單，成為中國(guó)近年來(lái)果樹(shù)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要樹(shù)種。２００７年中國(guó)甜櫻桃栽培面積約９．７萬(wàn)ｈｍ２，產(chǎn)量４０萬(wàn)ｔ左右，主要集中在環(huán)渤海灣的遼寧、山東一帶［２］。甜櫻桃果實(shí)酸甜可口，且營(yíng)養(yǎng)豐富，還有很高的醫(yī)用價(jià)值，被譽(yù)為“果中珍品”［３］。近年來(lái)隨著無(wú)性繁殖代數(shù)的越來(lái)越多，病毒病逐漸成為影響甜櫻桃產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素［１］。

據(jù)國(guó)外報(bào)道，目前核果類(lèi)病毒中櫻屬病毒主要有６８種，其中可以侵染甜櫻桃的病毒約有３４種，比較常見(jiàn)的甜櫻桃病毒主要有２０種［１］。中國(guó)自開(kāi)展甜櫻桃病毒病的研究以來(lái)，已經(jīng)先后檢測(cè)并報(bào)道了７種病毒，分別是李屬壞死環(huán)斑病毒（ＰＮＲＳＶ）［４，５］、李矮縮病毒（ＰＤＶ）［６］、蘋(píng)果褪綠葉斑病毒（ＡＣＬＳＶ）［６］、櫻桃銼葉病毒（ＣＲＬＶ）［７］、櫻桃病毒Ａ（ＣＶＡ）［８］、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（ＣＧＲＭＶ）［９］、櫻桃小果病毒－２（ＬＣｈＶ－２）［１０］。目前已初步明確了中國(guó)甜櫻桃主產(chǎn)區(qū)病毒病的種類(lèi)、危害，并在病毒檢測(cè)方面取得了一定的進(jìn)展，本研究結(jié)合自己的研究成果，綜述了中國(guó)甜櫻桃病毒病及其檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，期望為今后甜櫻桃病毒病的研究提供參考。

１甜櫻桃主要病毒、危害及特性

１．１李屬壞死環(huán)斑病毒（Ｐｒｕｎｕｓ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，ＰＮＲＳＶ）

ＰＮＲＳＶ是１９３２年由Ｖａｌｌｅａｕ［１１］在李和桃樹(shù)上首次發(fā)現(xiàn)的，它可以引起環(huán)斑病害，隨后在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。該病毒主要侵染歐洲甜櫻桃、酸櫻桃（Ｐ． ｃｅｒａｓｕｓ）、桃（Ｐ． ｐｅｒｓｉａ）、蘋(píng)果（Ｍａｌｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、杏（Ｐ． ａｒｍｅｎｉａｃａ）和洋李（Ｐ． ｄｏｍｉｓｔｉｃａ）等李屬和薔薇屬植物［１２］，寄主多達(dá)１８０多種植物。

ＰＮＲＳＶ是分布最廣、經(jīng)濟(jì)上危害最嚴(yán)重的李屬病毒。常見(jiàn)的危害癥狀包括壞死環(huán)斑、碎葉、帶狀葉、粗花葉，有時(shí)還會(huì)產(chǎn)生耳突，病葉出現(xiàn)壞死斑，中間部分壞死、脫落形成穿孔。該病毒主要通過(guò)種子、花粉、線蟲(chóng)等傳播，也可以通過(guò)機(jī)械調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播［１］。ＰＮＲＳＶ對(duì)大櫻桃危害嚴(yán)重，各國(guó)對(duì)其非常重視，１９９２年中國(guó)將其列為入境檢疫危險(xiǎn)性有害生物［１３］。

ＰＮＲＳＶ屬于雀麥花葉病毒科（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ），等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬（Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ）成員。病毒粒體球形，直徑約為２３ ｎｍ，線形正義ｓｓＲＮＡ分子，三分體基因組（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３）。其中，ＲＮＡ１和ＲＮＡ２為單順?lè)醋樱謩e編碼病毒的復(fù)制酶蛋白Ｐ１和Ｐ２，ＲＮＡ３為雙順?lè)醋樱幋a病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白（ＭＰ 或者ＯＲＦ３ａ），亞基因組ＲＮＡ４參與病毒的外殼蛋白（ＣＰ或者ＯＲＦ３ｂ）的表達(dá)。２００１年Ｔｅｒｌｉｚｚｉ等［１４］又發(fā)現(xiàn)ＰＮＲＳＶ病毒粒子里還包含有ＲＮＡ５。根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)，將ＰＮＲＳＶ分為３種血清型，即ＣＨ３、ＣＨ９、ＣＨ３０［１５］和2種致病型Ｍ和Ｒ［１１］（溫和致病型和皺縮花葉病型）。按照分子生物學(xué)及其序列同源性分析，ＰＮＲＳＶ又可分為組Ｉ（ＰＶ３２）、組Ⅱ（ＰＶ９６）和組Ⅲ（ＰＥ５）［１３－１５］３組，其中，皺縮花葉病型株系分在組Ｉ；溫和致病型株系分在組Ⅱ；組ＩＩＩ中的株系既有溫和致病型的株系也有引起嚴(yán)重癥狀的類(lèi)型［１６］。

１９９６年Ｚｈｏｕ等［４］利用血清學(xué)試劑盒在中國(guó)首次報(bào)道了ＰＮＲＳＶ的發(fā)生；同年李青等［５］利用ＥＬＩＳＡ法對(duì)北京地區(qū)的桃、櫻桃上ＰＮＲＳＶ的發(fā)生情況進(jìn)行了檢測(cè)；１９９８年阮小鳳等［６］對(duì)甜櫻桃上ＰＮＲＳＶ等病毒感染情況進(jìn)行ＥＬＩＳＡ檢測(cè)，ＰＮＲＳＶ感染率為２１．４％。２０００年侯義龍［１７］率先在國(guó)內(nèi)建立起李屬植物ＰＮＲＳＶ及ＰＤＶ的ＲＴ－ＰＣＲ分子檢測(cè)體系；代紅艷等［１８］完成了甜櫻桃莖尖組培苗中ＰＮＲＳＶ的ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)。２００５年李明福等［１９］在北京甜櫻桃上發(fā)現(xiàn)了ＰＮＲＳＶ。２０１１年本課題組在借鑒前人的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了新的ＰＮＲＳＶ的ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)方法，并對(duì)山東地區(qū)甜櫻桃常見(jiàn)病毒的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查檢測(cè)［１３］，其中ＰＮＲＳＶ感染率為３８％（此結(jié)果未發(fā)表）。

１．２李矮縮病毒（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ，ＰＤＶ）

１９３６年由Ｔｈｏｍａｓ［２０］首次報(bào)道，分布在歐洲、美洲、日本、澳大利亞和新西蘭等李屬果樹(shù)種植區(qū)。主要侵染歐洲甜櫻桃、洋李、桃、圓葉櫻桃（Ｐ．ｍａｈａｌｅｂ）、櫻花（Ｐ． ｓｅｒｒｕｌａｔａ）、梨（Ｐｙｒｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）等植物。

ＰＤＶ可引起櫻桃黃花葉病、櫻桃褪綠環(huán)斑病，與ＰＮＲＳＶ侵染植物的癥狀相似，葉片細(xì)長(zhǎng)畸形、產(chǎn)生褪綠壞死環(huán)斑、黃化花葉等癥狀。ＰＤＶ與ＰＮＲＳＶ

２種病毒常常造成復(fù)合侵染，從而造成更嚴(yán)重的危害。ＰＤＶ主要通過(guò)嫁接、種子、花粉傳播［１］。

ＰＤＶ為雀麥花葉病毒科等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬成員。球狀病毒粒子，直徑約為２２ ｎｍ［２１］。基因組有３條正義ｓｓＲＮＡ，ＲＮＡ１和ＲＮＡ２編碼病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的蛋白，ＲＮＡ３編碼ＭＰ和ＣＰ蛋白，ＣＰ蛋白由ＲＮＡ４表達(dá)，ＲＮＡ４和ＲＮＡ３一起被包裹。

ＰＤＶ在全世界普遍發(fā)生，為中國(guó)入境檢疫危險(xiǎn)性有害生物。在國(guó)內(nèi)，１９９６年李青等［５］首次報(bào)道甜櫻桃感染有ＰＤＶ。２０００年侯義龍［１７］應(yīng)用ＲＴ－ＰＣＲ方法在國(guó)內(nèi)建立起ＰＤＶ的分子生物學(xué)檢測(cè)體系，２００５年在北京、大連地區(qū)的桃、櫻桃及櫻桃組培苗中檢測(cè)到ＰＮＲＳＶ、ＰＤＶ［２２，２３］。２００９年趙世恒等［２４］再次從北京懷柔地區(qū)檢測(cè)到ＰＤＶ。２０１１年宗曉娟等［２５］建立了新的ＰＤＶ的ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)方法，在山東地區(qū)甜櫻桃果園中檢測(cè)到甜櫻桃的ＰＤＶ感病植株。

１．３蘋(píng)果褪綠葉斑病毒（Ａｐｐｌｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，ＡＣＬＳＶ）

在中國(guó)ＡＣＬＳＶ發(fā)生普遍，對(duì)蘋(píng)果、甜櫻桃等造成嚴(yán)重影響，感染病毒后會(huì)使其生長(zhǎng)量減少１６％～３６％，產(chǎn)量降低１６％～６０％，極大地危害果品產(chǎn)量和質(zhì)量。ＡＣＬＳＶ可以單獨(dú)感染，也可以與其他病毒復(fù)合感染果樹(shù)，引起果樹(shù)衰退病，苗木及嫁接的根、新梢、葉、花、果均表現(xiàn)出癥狀。例如，ＡＣＬＳＶ可以和ＰＮＲＳＶ協(xié)同侵染，會(huì)造成櫻桃壞死線紋病，染病葉片上出現(xiàn)呈帶狀的褪綠斑最終壞死。ＡＣＬＳＶ可以經(jīng)機(jī)械傳播、嫁接傳播或通過(guò)無(wú)性繁殖材料傳播，也可通過(guò)種子傳播［１］。

ＡＣＬＳＶ為纖毛病毒屬（Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ）重要成員之一，其病毒粒體呈彎曲的線狀，病毒粒子為螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)約７２０ ｎｍ，直徑約１２ ｎｍ，病毒為線形正義ｓｓＲＮＡ，長(zhǎng)約７ ５５５ ｎｔ。單分體基因組ＲＮＡ含有３個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀碼框（ＯＲＦｓ），最大的ＯＲＦ編碼復(fù)制酶（２１６．５ ｋＤａ），其余２個(gè)可能編碼移動(dòng)蛋白（５０．４ ｋＤａ）和外殼蛋白（２１．４ ｋＤａ）［２６，２７］。

洪霓等［２８］利用蘋(píng)果分離株制備的ＡＣＬＳＶ抗血清對(duì)田間果樹(shù)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果成功檢測(cè)出桃樹(shù)和梨樹(shù)上的ＡＣＬＳＶ。早期阮小鳳等［６］利用ＥＬＩＳＡ法對(duì)陜西甜櫻桃病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ＰＮＲＳＶ、ＰＤＶ、ＡＣＬＳＶ發(fā)生率較高，李春敏等［２９］對(duì)昌黎甜櫻桃上的蘋(píng)果褪綠葉斑病毒進(jìn)行ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ檢測(cè)， １４株甜櫻桃樹(shù)上蘋(píng)果褪綠葉斑病毒感染率為４７．１％。２０００年侯義龍［１７］建立了包括ＡＣＬＳＶ在內(nèi)的主要果樹(shù)病毒的ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)體系，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

１．４櫻桃銼葉病毒（Ｃｈｅｒｒｙ rａｓｐ lｅａｆ vｉｒｕｓ，ＣＲＬＶ）

Ｂｏｄｉｎｅ等［３０］首次在野生櫻桃上發(fā)現(xiàn)該病毒。櫻桃銼葉病的癥狀是多樣性的，正常葉的葉面為左右對(duì)稱，葉片呈橢圓形，病葉表現(xiàn)明顯的葉緣皺縮，嚴(yán)重的缺刻現(xiàn)象，形狀變得極不規(guī)則。在田間條件下，侵染還會(huì)誘發(fā)其他癥狀，包括：小葉、節(jié)間斷縮、失綠黃化、葉脈白化、果實(shí)小、葉片背面突起等。對(duì)中國(guó)櫻桃實(shí)生砧的５年生甜櫻桃的衰弱癥狀檢查發(fā)現(xiàn)，枝條韌皮部和形成層發(fā)生褐變，短枝很快枯死，大枝逐步死亡，最后整株枯死［７］。ＣＲＬＶ自然寄主有歐洲甜櫻桃、圓葉櫻桃和蘋(píng)果等，觀賞性櫻花可作為銼葉病毒的中間寄主，在甜櫻桃栽培區(qū)不宜種植。主要通過(guò)線蟲(chóng)傳播（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ａｍｅｒｉｃａｎａ），也可經(jīng)嫁接、花粉、昆蟲(chóng)和螨類(lèi)傳播，包括葉螨、葉蟬等［３１，３２］。

ＣＲＬＶ屬于豇豆花葉病毒科線蟲(chóng)多面體病毒屬（Ｃｏｍｖｉｒｉｄａｅ nｅｐｏｖｒｉｕｓ）。病毒粒子二十面體，呈等軸對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑約３０ ｎｍ。二分體基因組，ＲＮＡ１長(zhǎng)６ ９９２ ｎｔ，ＲＮＡ２長(zhǎng)３ ２７４ ｎｔ［３２］。２００２年譚海東等［７］通過(guò)電鏡觀察和紫外分光光度計(jì)的檢測(cè)方法，首次報(bào)道了櫻桃銼葉病在中國(guó)的發(fā)生情況，并提純到該病毒。

１．５櫻桃病毒Ａ（Ｃｈｅｒｒｙ ｖｉｒｕｓ Ａ，ＣＶＡ）

ＣＶＡ是１９９５年由Ｊｅｌｋｍａｎｎ［３３］在克隆ＬＣｈＶ的ｃＤＮＡ?xí)r意外發(fā)現(xiàn)的，會(huì)與ＬＣｈＶ復(fù)合發(fā)生，但并不影響ＬＣｈV的癥狀的表達(dá)［３４］。ＣＶＡ最初僅在英國(guó)發(fā)生，后來(lái)陸續(xù)傳播到德國(guó)、加拿大和波蘭等地［３５］。ＣＶＡ主要侵染歐洲甜櫻桃、酸櫻桃和杏等李屬植物。ＣＶＡ作為一種典型的潛隱性病毒，寄主無(wú)明顯癥狀，可通過(guò)嫁接傳播。

ＣＶＡ屬于發(fā)形病毒屬（Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ），病毒呈彎曲線狀，長(zhǎng)６４０～７００ ｎｍ。基因組ＲＮＡ含有２個(gè)開(kāi)放性閱讀框（ＯＲＦｓ），其中ＯＲＦ１編碼包含著復(fù)制酶蛋白的多聚蛋白，約為２６６ ｋＤａ。ＯＲＦ２可能編碼病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白，約為５２ ｋＤａ［１］。

２００９年在云南昆明的甜櫻桃樣品上檢測(cè)發(fā)現(xiàn)到ＣＶＡ［８］，這是該病毒在中國(guó)甜櫻桃上的首次報(bào)道。２０１０年在北京等地的甜櫻桃果樹(shù)上也發(fā)現(xiàn)ＣＶＡ的存在［３６］，發(fā)生較為普遍。２０１１年本課題組在山東地區(qū)病毒病的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)ＣＶＡ感染率約為６０％（此結(jié)果未發(fā)表）。

１．６櫻桃小果病毒（Ｌｉｔｔｌｅ ｃｈｅｒｒｙ ｖｉｒｕｓ，ＬＣｈＶ）

櫻桃小果病嚴(yán)重危害歐洲甜櫻桃和酸櫻桃，發(fā)生普遍，最初發(fā)現(xiàn)于加拿大英屬哥倫比亞?wèn)|部［３７］，在歐洲大部分地區(qū)和北美均有相關(guān)病例報(bào)道。２００４年波蘭首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)了ＬＣｈＶ－１［３５］。

ＬＣｈＶ引起櫻桃小果病癥狀復(fù)雜多變，表現(xiàn)程度常依季節(jié)、地區(qū)和果園的不同有很大的差異。典型癥狀有葉片邊緣輕微卷曲，發(fā)病葉片在夏末和秋季變?yōu)榧t色或青銅色［３７］，侵染果實(shí)會(huì)使其不能完全成熟，著色不完全，產(chǎn)生斑點(diǎn)，果實(shí)小，畸形，收獲時(shí)只有正常果實(shí)的１／２ ～１／３大小。受影響的果實(shí)呈現(xiàn)暗紅色、三角狀，口味下降，果實(shí)成熟過(guò)晚，據(jù)報(bào)道更易侵害具有暗紅色果實(shí)的栽培品種 ［３８］。ＬＣｈＶ通過(guò)汁液和昆蟲(chóng)介體傳播，１９８６年在加拿大發(fā)現(xiàn)新的傳播介體為蘋(píng)果粉蚧（Ｐｈｅｎａｃｏｃｃｕｓ ａｃｅｒｉｓ）［３９］。

櫻桃小果病主要與2個(gè)分離物ＬＣｈＶ－１、ＬＣｈＶ－２有關(guān)，都為長(zhǎng)線形病毒科（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ）長(zhǎng)線形病毒屬（Ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｖｉｒｕｓ），單分體基因組，病毒核酸為單分子線形正義ｓｓＲＮＡ。病毒粒子呈彎曲的長(zhǎng)線型，螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)１ ２５０～２ ０００ ｎｍ，寬１２ ｎｍ［４０］。

櫻桃小果病的病原研究進(jìn)展很慢，直到１９９７年ＬＣｈＶ的全序列被測(cè)出［４０］，對(duì)ＬＣｈＶ 的研究才有了突破性的進(jìn)展。２０１１年中國(guó)首次在云南昆明櫻花和甜櫻桃中發(fā)現(xiàn)ＬＣｈＶ－２［１０］，這是ＬＣｈＶ－２在中國(guó)的首次系統(tǒng)報(bào)道。中國(guó)至今未有ＬＣｈＶ－１和ＬＣｈＶ－２在甜櫻桃上共同侵染的報(bào)道。

１．７櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Ｃｈｅｒｒｙ ｇｒｅｅｎ ｒｉｎｇ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，ＣＧＲＭＶ）

１９３７年在美國(guó)密歇根州的酸櫻桃上首次發(fā)現(xiàn)了ＣＧＲＭＶ，可侵染幾種李屬植物，包括酸櫻桃、甜櫻桃、櫻花、桃、杏。該病毒在北美、歐洲、新西蘭、非洲和亞洲等地區(qū)分布極廣［４１］。

ＣＧＲＭＶ屬于凹陷病毒屬（Ｆｏｖｅａｖｉｒｕｓ），是單分子線形正義ｓｓＲＮＡ，無(wú)ＤＮＡ階段，其基因組長(zhǎng)８ ３７２ ｎｔ，除３′端ｐｏｌ（Ａ）尾巴外，含５個(gè)開(kāi)放閱讀框架（ＯＲＦｓ）［４１］。ＯＲＦ１編碼依賴ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶；ＯＲＦ２是1個(gè)三基因框，編碼解旋酶；ＯＲＦ３編碼衣殼蛋白；其余２個(gè)的作用還未確定［４２］。Ｚａｇｕｌａ等［４３］分離出１個(gè)ＣＧＲＭＶ墨西哥分離物，得知病毒粒子長(zhǎng)約１ ０００～２ ０００ ｎｍ，直徑５～６ ｎｍ，有１個(gè)２．５×１０６ Ｄａ的ｓｓＲＮＡ，２５ ｋＤａ衣殼蛋白。

ＣＧＲＭＶ感染酸櫻桃導(dǎo)致葉片黃化、次脈周?chē)瞪唏g等癥狀，但在甜櫻桃及其他李屬作物上為潛隱性病毒，侵染后通常無(wú)癥狀。Ｚｈａｎｇ等［４２］從美國(guó)密歇根州的酸櫻桃中檢測(cè)到ＣＧＲＭＶ；Ｉｓｏｇａｉ等［４４］在日本甜櫻桃上報(bào)道了ＣＧＲＭＶ；Ｋｏｍｏｒｏｗｓｋａ［４５］等從波蘭甜櫻桃、Ｓｉｐａｈｉｏｇｌｕ等［４６］從土耳其甜櫻桃中分離到病毒分離株；２０１１年我國(guó)首次利用ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)技術(shù)在甜櫻桃等李屬植物中發(fā)現(xiàn)了ＣＧＲＭＶ［９］。

２甜櫻桃病毒檢測(cè)技術(shù)

２．１指示植物檢測(cè)法

草本指示植物法：該方法一般采用汁液接種法。昆諾藜、煙草可作為李屬植物病毒常用指示植物［４７］。中國(guó)利用黃瓜、南瓜和美麗豬屎豆作為草本指示植物，對(duì)ＰＤＶ、ＰＮＲＳＶ在不同指示植物上的癥狀表現(xiàn)進(jìn)行了檢測(cè)和研究，并首次利用生物學(xué)方法檢測(cè)出ＰＤＶ［４８，４９］；木本指示植物法：目前國(guó)際上通過(guò)的用于田間鑒定的指示植物有５種［５０］，分別為山櫻桃的Ｓｈｉｒｏｆｕｇｅｎ和Ｋｗａｎｚａｎ，甜櫻桃的濱庫(kù)（Ｂｉｎｇ）、賽姆（Ｓａｍ）、凱彌戴柯斯（Ｃａｎｎｉｄｅｘ）。根據(jù)指示植物和所鑒定病毒對(duì)溫度的要求，在控制溫度的溫室條件下也可進(jìn)行鑒定。常用的標(biāo)準(zhǔn)李屬指示植物有桃ＧＦ３０５、Ｅｌｂｅｒｔａ、山櫻桃Sｈｉｒｏｆｕｇｅｎ［５１］。

２．２電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡能直接觀察到病毒粒子的形態(tài)特征，可將病毒提純后對(duì)病毒粒體直接觀察。在電子顯微鏡檢測(cè)的基礎(chǔ)上，又發(fā)展起來(lái)的免疫吸附電鏡技術(shù)和膠體金免疫電鏡技術(shù)，使病毒檢測(cè)的靈敏性和直觀性大幅度提高。但由于果樹(shù)病毒濃度低，分布不均勻，因此電鏡在果樹(shù)病毒檢測(cè)中應(yīng)用較少。

２．３酶聯(lián)免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）

目前，在植物病毒的檢測(cè)上應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）。此方法通過(guò)抗原—抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。最早ＥＬＩＳＡ為直接雙抗體夾心法（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）。應(yīng)用該技術(shù)已成功檢測(cè)出ＡＣＬＳＶ［５］、ＰＮＲＳＶ［５，６］、ＰＤＶ［６］。后來(lái)又出現(xiàn)了Ａ蛋白夾心－ＥＬＩＳＡ法（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）［５２］和間接雙抗體夾心法［５０］，其準(zhǔn)確率比ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ 高。雖然酶聯(lián)免疫吸附法精確度較高，但有一定的局限性。例如，在某些情況下有的病毒缺乏外殼蛋白，而類(lèi)病毒則沒(méi)有外殼蛋白，無(wú)法運(yùn)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)；受病毒系統(tǒng)和復(fù)合侵染的木本植物，無(wú)法完成純化病毒和制備抗血清；寄主植物中低濃度的病毒也無(wú)法檢測(cè)。

２．４分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)是通過(guò)檢測(cè)病毒核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）來(lái)證實(shí)病毒的存在。此技術(shù)比ＥＬＩＳＡ靈敏度高，特異性強(qiáng)、快速，可用于大量樣品的檢測(cè)，適應(yīng)范圍廣，其應(yīng)用對(duì)象為ＲＮＡ病毒、ＤＮＡ病毒及類(lèi)病毒。目前，常用的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括核酸分子雜交技術(shù)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（ＰＣＲ）、雙鏈ＲＮＡ電泳技術(shù)（ｄｓＲＮＡ）等。國(guó)外許多學(xué)者采用ＰＣＲ技術(shù)檢測(cè)果樹(shù)病毒，并取得了很好的效果。新發(fā)展的ＲＴ-ＰＣＲ技術(shù)是以ＰＣＲ技術(shù)為基礎(chǔ)衍生出的病毒檢測(cè)方法，可以檢測(cè)ｆｇ（１０-１５）數(shù)量級(jí)的植物病毒及大規(guī)模的樣品［８－１０，１７－１９］。近年來(lái)，在ＲＴ-ＰＣＲ基礎(chǔ)上又發(fā)展了ＩＣ-ＲＴ-ＰＣＲ和多重ＩＣ-ＲＴ-ＰＣＲ，實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ等，目前應(yīng)用較多的是ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)技術(shù)。２０００年侯義龍［１７］應(yīng)用ＲＴ－ＰＣＲ 技術(shù)檢測(cè)出ＡＣＬＳＶ、ＰＮＲＳＶ、ＡＳＧＶ及ＡＳＰＶ ４種病毒，同時(shí)調(diào)查發(fā)現(xiàn)８年生甜櫻桃品種巨紅ＡＣＬＳＶ感染率高達(dá)８８％，ＰＮＲＳＶ感染率為７６％。實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ技術(shù)也將進(jìn)一步用于果樹(shù)病毒的研究中。分子生物學(xué)技術(shù)在病毒檢測(cè)上的應(yīng)用將會(huì)有更廣闊的前景。

３存在的問(wèn)題與展望

１）在當(dāng)今技術(shù)水平下，對(duì)于甜櫻桃病毒病的防治尚無(wú)有效的化學(xué)藥劑，建立快速有效的檢測(cè)方法，加強(qiáng)病毒檢疫檢驗(yàn)是防治病毒病的惟一途徑。目前分子生物學(xué)方法特別是核酸分子雜交技術(shù)、雙鏈ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）電泳技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰＣＲ）的發(fā)展和應(yīng)用極大地推動(dòng)了甜櫻桃病毒病的檢測(cè)和研究。近年來(lái)，在ＰＣＲ基礎(chǔ)上又出現(xiàn)了免疫捕捉ＰＣＲ（ＩＣ－ＰＣＲ）技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）技術(shù)等，快速、精確的檢測(cè)技術(shù)有待進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用于中國(guó)甜櫻桃產(chǎn)業(yè)中。

２）目前國(guó)際上已確定的櫻桃病毒病有３4種，而中國(guó)有報(bào)道的侵染甜櫻桃的病毒僅有７種，中國(guó)對(duì)甜櫻桃病毒病病原的研究還不夠全面。有必要對(duì)中國(guó)的甜櫻桃病毒病的株系種類(lèi)、分布和危害進(jìn)行詳細(xì)的調(diào)查。明確中國(guó)甜櫻桃病毒病的種類(lèi)、發(fā)生和分布情況，進(jìn)一步為田間甜櫻桃病毒病的檢測(cè)和防治提供依據(jù)。

３）近幾年隨著甜櫻桃苗木引種和調(diào)運(yùn)，甜櫻桃新病毒病隨著苗木傳入國(guó)內(nèi)，并在國(guó)內(nèi)各地區(qū)逐漸發(fā)生，凸顯了苗木病毒檢疫存在的問(wèn)題。應(yīng)該加大苗木進(jìn)出口檢疫監(jiān)管力度，加強(qiáng)苗木國(guó)內(nèi)調(diào)運(yùn)檢測(cè)檢驗(yàn)工作，嚴(yán)格控制有害病毒廣泛傳播。

４）加強(qiáng)果樹(shù)脫毒與無(wú)病毒苗木繁殖，建立無(wú)病毒苗木良種繁育體系，是保證甜櫻桃產(chǎn)量和提高品質(zhì)的基本措施。

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收稿日期：２０１２－０２－０３

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部“９４８”項(xiàng)目（２０１１－Ｚ４０）；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（２００９０３０１９）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程［魯農(nóng)良種字（２０１０）６號(hào)］

作者簡(jiǎn)介：王文文（１９８６－），女，山東濟(jì)寧人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閳@藝植物病理學(xué)，（電話）１５９５４７６２５８１（電子信箱）ｗａｎｇｗｅｎｗｅｎＢ＠１２６．ｃｏｍ；

通訊作者，嚴(yán)雪瑞，副教授，博士，主要從事小漿果病蟲(chóng)害研究，（電子信箱）ｚｂｙｘｒ＠１２６．ｃｏｍ；劉慶忠，研究員，主要從事果樹(shù)生物技術(shù)

與資源育種研究，（電子信箱）ｑｚｌｉｕ＠ｓｄｉｐ．ｃｎ。