REMI介導紅曲霉遺傳轉化條件的優化

周禮紅 陳平 趙永霞 荊雯雯 李祝 葛永儀

摘要：為了構建限制性內切酶介導的整合（ＲＥＭＩ）技術介導的紅曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遺傳轉化系統，以潮霉素B作為抗性篩選標記，ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＢ１００３、ｐＡＮ７－１作為轉化質粒，采用ＲＥＭＩ技術轉化紅曲霉。結果表明，用ＲＥＭＩ技術介導紅曲霉轉化時，質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３適合于紅曲霉的轉化。環狀質粒與線性質粒的轉化率無顯著差別；在用ＲＥＭＩ技術介導轉化時添加酶切緩沖液不利于轉化；原生質體濃度為１×１０７～１×１０８個／ｍＬ時，每微克質粒可獲得的潮霉素Ｂ抗性轉化子為２ ８００～３ ２００個；ＨｉｎｄⅢ介導轉化時的最佳酶用量為１０5～１２０ Ｕ；在質粒用量為８ μｇ／１００ μＬ時轉化率最高。

關鍵詞：紅曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遺傳轉化；限制性內切酶介導的整合（REMI）

中圖分類號：Ｑ９３３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）18－4129-05

Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka ｂｙ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ－Mｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ （ＲＥＭＩ）

ＺＨＯＵ Ｌｉ－ｈｏｎｇ，ＣＨＥＮ Ｐｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｙｏｎｇ－ｘｉａ，ＪＩＮＧ Ｗｅｎ－ｗｅｎ，ＬＩ Ｚｈｕ，ＧＥ Ｙｏｎｇ－ｙｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＲＥＭＩ）， ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｐｈ ｇｅｎｅ ａｓ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ， ｐＣＢ１００３ ａｎｄ ｐＡＮ７－１ ａｓ ｖｅｃｔｏｒ， ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ Ｍ． ａｎｋａ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｂｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｙ ＲＥＭＩ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ ａｎｄ ｐＣＢ１００３ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｎｏ ｍａｔｔｅｒ ｉｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｏｒ ｎｏｔ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １×１０７～１×１０８ ｍＬ ｗｅｒｅ ｆｉｔ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｍ． ａｎｋａ， ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ２ ８００～３ ２００ ｉｎｄ．／μｇ ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｄｏｓｅ ｗａｓ １０5～１２０ Ｕ ａｎｄ ８ μｇ／１００ μＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｐ．； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＲＥＭＩ）

限制性內切酶介導的整合（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ eｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ iｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ＲＥＭＩ）技術是將ＤＮＡ轉化進入真核細胞，并產生非同源整合的一種方法。ＲＥＭＩ的非同源整合機理與非同源末端連接（Ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）相關［１－４］，整合的過程［５］可簡單歸結為三步：首先在轉化過程中使線性化ＤＮＡ的酶隨線性化ＤＮＡ進入核內；第二，限制性內切酶在特定識別位點酶切宿主染色體ＤＮＡ；第三，染色體ＤＮＡ和轉化片段在體內互補末端連接產生非同源整合事件。

１９９１年Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等［６］首次將ＲＥＭＩ技術應用于極易同源整合的Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。Ｋｕｓｐａ等［７］首先將ＲＥＭＩ技術應用于Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｉｕｍ克隆發育基因，構建了ＲＥＭＩ－ＲＦＬＰ（限制性片段長度多態性）圖譜［８，９］，并克隆了很多發育基因，使發育途徑的研究變得更加容易。應用該方法已分離到幾個植物致病真菌的毒力因子［５］。ＲＥＭＩ技術還成功應用于子囊菌Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ［１０］和玉米致病真菌Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ［１１］、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ［１２］的遺傳互補分析，以及啟動子捕獲等。

研究探討了不同限制性內切酶介導轉化紅曲霉的能力，以及酶切緩沖液和不同質粒對轉化率的影響，同時優化了酶的用量、受體細胞濃度等條件。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌株、質粒與培養基菌株Ｍ７５７７是野生型紅曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ａｎｋａ），由貴州大學真菌資源研究所分離、保存。

用于遺傳轉化的質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ由法國Ｓｉｌａｒ教授惠贈，該質粒攜帶潮霉素Ｂ抗性基因（ｈｐｈ）［１３］，是用限制性內切酶ＨｉｎｄⅢ酶切線性化的。

質粒ｐＡＮ７－１［１４］帶有來自Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｇｐｄ基因的啟動子和ｔｒｐＣ基因［１５］的終止子。用ＨｐｈⅠ酶切質粒ｐＡＮ５２－１，用Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶補平末端，再用ＢａｍＨⅠ酶切得到１．１ ｋｂ ｈｐｈ基因片段（ｈｐｈ基因缺失了不影響酶功能的前３個密碼子）［１６］，與Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ 帶有起始密碼子ＡＴＧ的ｇｐｄ基因５′端融合；ｈｐｈ基因下游密碼子區域與Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ基因末端區域的ＨｐｈⅠ－ＢａｍＨⅠ片段融合，克隆到質粒ｐＡＮ５２－１（克隆前先用ＮｃｏⅠ酶切ｐＡＮ５２－１，用Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶補平末端，再用Ｂａｍ Ｈ Ｉ酶切）上構建得到ｐＡＮ７－１。

質粒ｐＣＢ１００３帶有來自ｐＣＳＮ４３［１７］的２．４ ｋｂ ＳａｌⅠ片段（含有潮霉素Ｂ抗性基因ｈｐｈ和來自Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｔｒｐＣ啟動子和終止子），通過單個堿基的改良消除了ｈｐｈ基因中的４個限制性內切酶位點：ＥｃｏＲⅠ（ＧＡＧＴＴＣ）、ＰｓｔⅠ（ＣＴＧＧＡＧ）、ＳｓｔⅡ（ＣＣＧＣＧＣ）和Ｂａｍ ＨＩ （ＧＧＴＴＣＣ），但ｈｐｈ基因編碼的氨基酸序列未變。通過ＰＣＲ技術消除ｔｒｐＣ終止子，獲得了１．４ ｋｂ的片段，并在片段兩端引入ＥｃｏＲⅠ、ＳａｌⅠ和ＨｐａⅠ位點，最后通過ＥｃｏＲⅠ位點亞克隆到ｐＵＣ１９構建得到ｐＣＢ１００３。

菌絲生長的ＣＭ培養基和產孢培養基按文獻［１８］配制，原生質體再生液體和固體培養基是分別于ＣＭ液體和瓊脂糖固體培養基中加入蔗糖，終濃度為０．６ ｍｏｌ／Ｌ；復蘇液體培養基、馬鈴薯葡萄糖液體培養基中加蔗糖，終濃度為０．６ ｍｏｌ／Ｌ。

１．１．２藥品與試劑各種限制性內切酶和ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶為Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司產品，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、Ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ購于Ｓｉｇｍａ公司，Ｓｎａｉｌａｓｅ購于華美生物工程公司，瓊脂糖購于Ｂｉｏｗｅｓｔ公司，質粒中量制備試劑盒為德國Ｑｉａｇｅｎ公司產品，其余試劑均為進口或國產分析純。

電擊轉化緩沖液Ⅰ含有１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、６００ ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＬｉＡｃ，用于不含聚乙二醇４ ０００的原生質體電擊轉化；電擊轉化緩沖液Ⅱ含有１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、６００ ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＬｉＡｃ、３００ ｇ／Ｌ聚乙二醇４ ０００，用于含聚乙二醇４ ０００的原生質體電擊轉化；電擊轉化緩沖液Ⅲ含有１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、２７０ ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＬｉＡｃ，用于萌發孢子的電擊轉化。

ＳＴＣ溶液含有１ ｍｏｌ／Ｌ山梨醇、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２，ＰＴＣ溶液含有４００ ｇ／Ｌ聚乙二醇４ ０００、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２。

１．２方法

１．２．１原生質體的制備參考文獻［19］。菌株Ｍ７５７７在產孢培養基上于３０ ℃培養７～１０ ｄ，收集孢子并制備成均一的濃度為１×１０８～１×１０９ 個／ｍＬ的孢子懸液。取２００ μＬ孢子懸液涂布于鋪有玻璃紙的ＰＤＡ平板上，于３０ ℃培養３０ ｈ，收集菌絲體，用１ ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４溶液洗１次。約３００ ｍｇ菌絲體加３０ ｍＬ裂解酶液，于３０ ℃以６０ ｒ／ｍｉｎ酶解２～３ ｈ，過濾，濾液于４ ℃、以３ ２００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。棄上清，用１．２ ｍｏｌ／Ｌ預冷的山梨醇溶液洗原生質體沉淀２次，分為２份。一份重懸于１．２ ｍｏｌ／Ｌ預冷的山梨醇溶液中，一份用預冷的ＳＴＣ溶液洗１次。兩份樣品均置于冰浴備用。

１．２．２質粒的線性化用ＨｉｎｄⅢ酶切線性化質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ。酶切反應體系：３６ μＬ １０×Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ，２０ μｇ ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ，１２ μＬ １０ Ｕ／μＬ ＨｉｎｄⅢ，加ｄｄＨ２Ｏ至３６０ μＬ，置于３７ ℃水浴２～４ ｈ，于６５ ℃水浴反應１５ ｍｉｎ，停止反應，然后分為２份，一份備用，稱為質粒Ａ液；另一份用苯酚－氯仿抽提純化，然后溶解于無菌去離子水，稱為質粒Ｂ液。

１．２．３ＲＥＭＩ技術的轉化方法參考文獻［20］。用預冷的ＳＴＣ溶液洗原生質體并再重懸，濃度調整至５×１０７個／ｍＬ。取１００ μＬ轉化用原生質體液，加入１ μｇ環狀質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ，輕輕吹吸混勻；分別加限制性內切酶ＨｉｎｄⅢ ３０～１９０ Ｕ，冰浴３０ ｍｉｎ，加１ ｍＬ ＰＴＣ，于室溫靜置４０～６０ ｍｉｎ，涂布于含有１２０ μｇ／ｍＬ潮霉素Ｂ的再生瓊脂糖固體培養基平板上，每個平板涂布２００ μＬ轉化液。于３０ ℃暗培養４～５ ｄ，統計轉化子數。

１．２．４最適質粒的選擇采用３個啟動子序列來源不同的環狀質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＢ１００３、ｐＡＮ７－１，用量為７５或１０５ Ｕ的限制性內切酶ＨｉｎｄⅢ、ＳａｃⅠ、ＢａｍＨⅠ，將１ μｇ不同質粒和限制性內切酶分別加到１００ μＬ ５×１０７個／ｍＬ原生質體中，對紅曲霉進行轉化試驗，以潮霉素B抗性轉化子數為指標評價和篩選適合轉化紅曲霉的質粒。

１．２．５最適限制性內切酶的選擇選擇７種不同的限制性內切酶為轉化質粒，其中平末端酶有ＳｍａⅠ和ＨｐａⅠ，５′端突出末端酶有ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌⅠ和ＥｃｏＲⅠ，３′端突出末端酶有ＫｐｎⅠ、ＳａｃⅠ，向１００ μＬ ５×１０６個／ｍＬ原生質體液中加入１ μｇ線性或環狀質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和７５ Ｕ限制性內切酶進行轉化試驗，以不加酶處理的作對照，以潮霉素B抗性轉化子數為指標評價和篩選合適的限制性內切酶。

１．２．６酶切緩沖液對轉化的影響試驗有７種試驗方案，１００ μＬ原生質體液中，①加質粒Ａ液和１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ，②加質粒Ｂ液、１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ和10×酶切緩沖液，③加質粒Ｂ液和１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ，④加環狀質粒、１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ和10×酶切緩沖液，⑤加環狀質粒和１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ，⑥加質粒Ｂ液，⑦加環狀質粒作為對照。然后輕輕吹吸混勻，冰浴３０ ｍｉｎ，加１ ｍＬ ＰＴＣ溶液，于室溫靜置４０～６０ ｍｉｎ。取轉化液涂布于含有１２０ μｇ／ｍＬ潮霉素Ｂ的再生瓊脂糖固體培養基平板上，每個平板涂布２００ μＬ，于３０ ℃暗培養４～５ ｄ，統計潮霉素B抗性轉化子數。

１．２．７最適原生質體濃度的選擇將８ μｇ質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和１０５ Ｕ限制性內切酶ＨｉｎｄⅢ分別加入１００ μＬ濃度分別為１．０×１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、１．０×１０８、１．５×１０８個／ｍＬ原生質體中進行轉化試驗。以潮霉素B抗性轉化子數為指標確定適合轉化的紅曲霉原生質體濃度。

１．２．８最適ＨｉｎｄⅢ用量的選擇在１００ μＬ含有８ μｇ環狀質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ的５×１０７個／ｍＬ原生質體中分別加入0、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１３５、１５０、１９０ Ｕ ＨｉｎｄⅢ進行轉化試驗。以潮霉素B抗性轉化子數為指標確定最適合轉化的ＨｉｎｄⅢ用量。

１．２．９最適質粒用量的選擇在１００ μＬ含有１００ Ｕ ＨｉｎｄⅢ的５×１０７個／ｍＬ原生質體中分別加入１、２、４、８、１６ μｇ質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ進行轉化試驗。以潮霉素B抗性轉化子數為指標確定最適合紅曲霉轉化的質粒用量。

２結果與分析

２．１最適質粒的選擇結果

為了探討不同構建方法得到的質粒對紅曲霉轉化的影響，試驗中用了３個啟動子序列來源不同的質粒進行轉化（質粒均未線性化），試驗中環狀質粒用量為１ μｇ，原生質體濃度為５×１０７個／ｍＬ。由表１可知，質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ對紅曲霉的轉化率非常高，轉化子達（２ ６７９±８）個／μｇ；ｐＣＢ１００３次之；ｐＡＮ７－１的轉化率最差，僅為15～４1個／μｇ。由此可知，質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３適合于紅曲霉的轉化，而ｐＡＮ７－１用于紅曲霉的轉化不理想。因此后續試驗所用質粒均為ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ。

２．２最適限制性內切酶的選擇結果

應用ＲＥＭＩ技術建立遺傳轉化系統時，限制性內切酶種類的選擇至關重要。為了選擇合適的限制性內切酶，首先選擇７種不同的限制性內切酶（包括５′端突出末端酶、３′端突出末端酶及平末端酶），以ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ為轉化質粒，轉化紅曲霉并確定轉化能力。

向１００ μＬ ５×１０６個／ｍＬ原生質體液中加入１ μｇ線性或環狀質粒和７５ Ｕ限制性內切酶進行轉化試驗。由圖１可知，３種不同末端酶都能較好地介導質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ轉化進入紅曲霉，潮霉素B抗性轉化子數都較未加限制性內切酶的對照提高了３倍以上，但提高幅度卻因酶種類的不同而存在較大差異。對于環狀質粒，５′端突出末端酶（ＨｉｎｄⅢ和ＳａｌⅠ）的作用效果優于平末端酶（ＨｐａⅠ和ＳｍａⅠ）和３′端突出末端酶（ＫｐｎⅠ）。其中，ＨｉｎｄⅢ和ＳａｌⅠ對轉化能力的提高和改善最有效，每微克質粒ＤＮＡ的轉化子數約是對照的１５倍。并且穩定性檢測表明約有７０％的轉化子穩定。

由圖１還可知，具有同種類型末端的限制性內切酶介導ＤＮＡ轉化紅曲霉的能力也存在很大差異。如平末端酶ＳｍａⅠ就優于ＨｐａⅠ，ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌⅠ優于ＥｃｏＲⅠ。此外，選用的限制性內切酶即使在被轉化的ＤＮＡ上不存在酶切位點，也仍能較好地介導ＤＮＡ轉化紅曲霉，如ＥｃｏＲⅠ。

因此，限制性內切酶ＨｉｎｄⅢ和ＳａｌⅠ有利于轉化。

２．３酶切緩沖液對轉化紅曲霉的影響

限制性內切酶在特定的環境條件和反應體系里才能很好地發揮功能。為了探討酶切緩沖液是否會影響限制性內切酶介導ＤＮＡ的轉化，選用了ＨｉｎｄⅢ來進行試驗，原生質體濃度為５×１０６個／ｍＬ。由表２可知，無論是線性質粒還是環狀質粒，在由限制性內切酶ＨｉｎｄⅢ介導轉化紅曲霉時，添加酶切緩沖液導致轉化率降低，以環狀質粒介導轉化ＤＮＡ時，轉化率下降尤為顯著。在限制性內切酶介導轉化時添加酶切緩沖液，不僅沒有促進轉化率的提高，反而降低了轉化能力。其原因可能是加入酶切緩沖液后，離子濃度增大，離子種類也增多，改變了轉化反應環境，從而影響到紅曲霉細胞膜的通透性。

從圖１和表２可知，質粒是否線性化對紅曲霉的轉化效果（包括轉化子數和轉化子穩定性）影響不顯著（Ｐ＞０．０５），為了簡便和節約，后續試驗用環狀質粒進行轉化更為合適。

２．４最適原生質體濃度的選擇結果

無論是真核生物還是原核生物，轉化時受體細胞（或者感受態細胞）的濃度是影響轉化率的一個重要因素。因此，用質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和１０５ Ｕ限制性內切酶ＨｉｎｄⅢ探討了原生質體濃度對于轉化紅曲霉的影響。由圖２可知，原生質體濃度為１×１０７～１×１０８個／ｍＬ時，每微克質粒ＤＮＡ可獲得的潮霉素Ｂ抗性轉化子為２ ８００～３ ３００個。當原生質體濃度低于１×１０７個／ｍＬ和高于１×１０８個／ｍＬ時，轉化子數開始大幅下降，表明原生質體濃度過低和過高都會不利于外源ＤＮＡ進入受體細胞內。

因此，原生質體濃度為１×１０７～１×１０８個／ｍＬ時最有利于轉化。

２．５最適ＨｉｎｄⅢ用量的選擇結果

ＲＥＭＩ介導轉化時，限制性內切酶的濃度是需要優化的重要條件之一，是影響轉化效率的關鍵因素。在１００ μＬ含有環狀質粒的５×１０７個／ｍＬ原生質體中分別加入不同濃度的ＨｉｎｄⅢ，結果如圖３，當ＨｉｎｄⅢ用量為０～７５ Ｕ時，隨著ＨｉｎｄⅢ用量的增加潮霉素Ｂ抗性轉化子數緩慢增多；當ＨｉｎｄⅢ用量超過７５ Ｕ時，轉化子數陡然上升，至１０５ Ｕ時達到最大。然后，隨著ＨｉｎｄⅢ用量繼續增大，轉化子數則開始減少，且差異顯著（Ｐ＜０．０５）。因而，ＨｉｎｄⅢ用量為１０5～１２０ Ｕ時最有利于轉化。

２．６最適質粒用量的選擇結果

１００ μＬ反應體系中加１、２ μｇ質粒時的轉化子數很少；當增到４ μｇ時轉化子數陡然增加，較１ μｇ時提高了１倍多；加到８ μｇ時，轉化子數較４ μｇ時顯著增多（Ｐ＜０．０５），有約３ ２００個／μｇ。再增加至１６ μｇ時轉化率又大幅下降（圖４）。表明質粒用量對轉化率有很大影響，最佳質粒用量約為８ μｇ／１００ μＬ。

３小結與討論

采用ＲＥＭＩ技術介導轉化時，質粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３適合于紅曲霉的轉化。質粒是否線性化對轉化率影響不大，但添加酶切緩沖液不利于轉化；原生質體濃度為１×１０７～１×１０８個／ｍＬ時最有利于轉化，ＨｉｎｄⅢ介導紅曲霉轉化時的最佳酶用量為１０5～１２０ Ｕ，質粒用量為８ μｇ／１００ μＬ時轉化率最高。

ＲＥＭＩ技術首次報道的是用于Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ的非同源ＤＮＡ轉化［６］，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ是第一個成功應用ＲＥＭＩ作為遺傳工具的絲狀真菌［１２］，隨后屢有報道。該技術不僅用于提高轉化率，還應用于其他的遺傳分析如基因和啟動子捕獲，遺傳互補分析等。

轉化反應體系中，外源ＤＮＡ和受體細胞（原生質體）的濃度之所以影響轉化子的數量，很大程度上可能是因為它們影響了外源ＤＮＡ進入細胞的能力，其原因可能是，原生質體細胞之間的碰撞頻率以及外源ＤＮＡ與受體細胞之間的碰撞頻率都會因反應體系中細胞和外源ＤＮＡ的濃度而發生變化，從而影響外源ＤＮＡ與受體細胞膜表面的接觸機率；在小生態中，細胞個體之間存在信號物質的傳遞，以此來調控細胞內外環境的平衡以及群落個體之間的平衡，由此來維持群落的生命，因此，反應體系中原生質體濃度會影響到細胞間的信號傳遞，從而調整細胞膜對胞外物質的識別、結合與輸送等；此外，外源ＤＮＡ在反應體系中的濃度也會影響到受體細胞信號物質的分泌及其在細胞間的傳遞，進而影響到細胞對特定胞外物質的攝入量。

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［６］ ＳＣＨＩＥＳＴＬ Ｒ Ｈ，ＰＥＴＥＳ Ｔ Ｄ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９１，８８（１７）：７５８５－７５８９．

［７］ ＫＵＳＰＡ Ａ，ＬＯＯＭＩＳ Ｗ Ｆ． Ｔａｇｇｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９２，８９（１８）：８８０３－８８０７．

［８］ ＫＵＳＰＡ Ａ，ＬＯＯＭＩＳ Ｗ Ｆ． ＲＥＭＩ－ＲＦＬＰ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，１３８（３）：６６５-６７４．

［９］ ＬＯＯＭＩＳ Ｗ Ｆ，ＷＥＬＫＥＲ Ｄ，ＨＵＧＨＥＳ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，１４１（１）：１４７－１５７．

［１０］ ＬＵ Ｓ，ＬＹＮＧＨＯＬＭ Ｌ，ＹＡＮＧ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔａｇｇｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ Ｔｏｘ１ ｌｏｃｕｓ ｏｆ Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９４，９１（２６）：１２６４９－１２６５３．

［１１］ ＢＯＬＫＥＲ Ｍ，ＢＯＨＮＥＲＴ Ｈ Ｕ，ＢＲＡＵＮ Ｋ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｔａｇｇｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＲＥＭＩ）［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９５，２４８（５）：５４７－５５２．

［１２］ ＳＡＮＣＨＥＺ Ｏ，ＮＡＶＡＲＲＯ Ｒ Ｅ，ＡＧＵＩＲＲＥ Ｊ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ （ＲＥＭＩ）［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９８，２５８（１）：８９－９４．

［１３］ ＳＩＬＡＲ Ｐ． Ｔｗｏ ｎｅｗ ｅａｓｙ ｔｏ ｕｓｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ［ＥＢ／ＯＬ］． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ／ｆｇｎ４２／ｓｉｌａｒ．ｈｔｍｌ，２０１０－０７－１３．

［１４］ ＰＵＮＴ Ｐ Ｊ，ＯＬＩＶＥＲ Ｒ Ｐ，ＤＩＮＧＥＭＡＮＳＥ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］． Ｇｅｎｅ，１９８７，５６（１）：１１７－１２４．

［１５］ ＭＵＬＬＡＮＥＹ Ｅ Ｊ，ＨＡＭＥＲ Ｊ Ｅ，ＲＯＢＥＲＴＩ Ｋ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｐＣ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，１９９（１）：３７－４５．

［１６］ ＫＡＳＴＥＲ Ｋ Ｒ，ＢＵＲＧＥＴＴ Ｓ Ｇ，ＩＮＧＯＬＩＡ Ｔ Ｄ． Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１９８４，８（５）：３５３－３５８．

［１７］ ＳＴＡＢＥＮ Ｃ，ＪＥＮＳＥＮ Ｂ，ＳＩＮＧＥＲ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎｅｗｓｌ，１９８９，３６（４）：７９－８１．

［１８］ ＬＡＫＲＯＤ Ｋ，ＣＨＡＩＳＲＩＳＯＯＫ Ｃ，ＳＫＩＮＮＥＲ Ｄ Ｚ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｂｉｎｏ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ［Ｊ］． Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，３０（６）：３６９－３７４．

［１９］ 周禮紅，李國琴，王正祥，等． 紅曲霉原生質體的制備、再生及其遺傳轉化系統［Ｊ］．遺傳，２００５，２７（３）：４２３－４２８．

［２０］ 周禮紅，諸葛健，王正祥． 紅曲霉不同轉化方法的比較［Ｊ］．遺傳，２００６，２８（４）：４７９－４８５．

收稿日期：２０１２－０４－２８

基金項目：貴州省科技廳農業攻關項目（黔科合ＮＹ字［２００８］３０５８）；貴州大學研究生創新基金項目（校研農２０１０００３）

作者簡介：周禮紅（１９７５－），女，貴州清鎮人，副教授，博士，主要從事發酵工程、真菌遺傳與育種研究工作，（電話）０８５１－３８５１１５８（電子信箱）

ｌｈｚｈｏｕ３３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。