幽門螺桿菌檢測方法研究新進展

邵軍麗，吳 豐

1.廣東醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣東東莞 523808;2.東莞中學松山湖學校生物科組

專題·幽門螺桿菌

幽門螺桿菌檢測方法研究新進展

邵軍麗1，吳 豐2

1.廣東醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣東東莞 523808;2.東莞中學松山湖學校生物科組

本文就近年來幽門螺桿菌檢測方法新進展作一簡要的概述，主要從細菌培養(yǎng)、快速尿素酶實驗、組織學檢查、尿素呼氣實驗、抗體檢測、糞便抗原檢測和分子生物學檢測等幾個方面展開。

幽門螺桿菌;檢測方法;快速尿素酶實驗;尿素呼氣實驗

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃腺癌、胃黏膜相關性淋巴瘤有著密切的聯(lián)系，在胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌患者中H.pylori感染率約90%。世界衛(wèi)生組織已把H.pylori列為第一類致癌因子，并明確為胃癌的危險因子。所以H.pylori感染的早診斷、早治療十分重要和必要。H.pylori檢測是H.pylori感染診斷的重要手段，本文就H.pylori檢測方法近年來的發(fā)展作一概述。

1 細菌培養(yǎng)

一般用腦心浸液(或哥倫比亞瓊脂或布氏瓊脂)添加一定量的血清或全血，選擇性抗生素做培養(yǎng)基，微氧條件培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落特征、涂片鏡檢、三酶(尿素酶、氧化酶、過氧化氫酶)試驗判定為H.pylori陽性或陰性。

H.pylori在37℃保存需要每隔4～7 d傳代才能保持其活力，而凍存的H.pylori復蘇又有成功率低、時間長的缺點。Xu等［1］發(fā)現(xiàn)在布氏或腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上將H.pylori深度穿刺，在37℃ 10%CO2條件下培養(yǎng)，無需傳代即可以保持活力56 d。

2 快速尿素酶試驗

快速尿素酶試驗(rapid urease test，RUT)原理是H.pylori富含的高活性尿素酶可分解尿素產(chǎn)生氨，使pH升高，指示劑顏色發(fā)生改變。盡管尿素酶并不只是H.pylori所特有，但胃內存在尿素酶是H.pylori存在的證據(jù)之一。

一般在胃鏡檢查時，鉗取近幽門處的胃竇黏膜活檢標本置于RUT試劑中，5 min內即可通過顏色變化判定結果。傳統(tǒng)的RUT試劑由2%尿素和酚紅組成。Mclntosh等［2］優(yōu)化了尿素的濃度和指示劑的種類，發(fā)現(xiàn)5%尿素和溴甲酚紫可以改善豬胃黏膜尿素酶活性的可視性。Hsu等［3］發(fā)現(xiàn)使用來自胃竇和胃體的雙樣本可以提高尿素酶檢測的靈敏度。

3 組織學檢查

一般將通過內鏡鉗取的活檢標本立即用10%甲醛固定，然后進行常規(guī)包埋、切片、染色、水洗等操作，最后鏡檢。鏡檢下H.pylori可呈稍彎曲狀、S狀、短弧狀、桿狀、海鷗狀。常用的染色方法有改良Warthin-Starry 銀鹽、改良 Giemsa、HE、Gimenez、石炭酸復紅、免疫組化等。改良Warthin-Starry銀鹽染色法的敏感度100%、特異度95.6%，明顯高于RUT和14C-尿素呼氣試驗(14C-urea breath test，14C-UBT)2 種方法［4］。劉莉等［5］比較了 HE、改良 Giemsa、免疫組化3種染色方法，結果是陽性率無顯著性差異，但免疫組化時H.pylori菌體與周圍組織對比度最強，最易識別。

放大內鏡結合窄帶成像技術(narrow-band imaging，NBI)能夠精確觀察消化道黏膜上皮形態(tài)，可以在內鏡下即時觀察預測H.pylori的感染，還可以預測胃炎的組織學嚴重程度和胃萎縮情況［6］。共聚焦激光顯微內鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)不僅能觀察黏膜表面上皮形態(tài)，還可以觀察到黏膜下組織形態(tài)，與NBI技術相比功能相同但診斷更精確。Ji等［7］利用CLE進行診斷，將胃黏膜表面具有白點、中性粒細胞和微小膿腫3種特征之一者診斷為H.pylori感染，診斷結果與常規(guī)組織學檢查結果有很好的相關性，其準確度、靈敏度和特異度分別為 92.8%、89.2%、95.7%。

4 尿素呼氣試驗

哺乳動物細胞中不存在尿素酶，而且H.pylori是胃內具有高活性尿素酶的細菌，所以可以通過UBT測定尿素酶的活性間接檢測H.pylori。檢測前受檢者口服同位素13C或14C標記的尿素膠囊，胃內H.pylori產(chǎn)生的尿素酶催化尿素迅速水解成NH4+和H13或H14，后者吸收入血液經(jīng)肺以13CO2或14CO2形式呼出，收集呼氣標本并測量13CO2或14CO2，根據(jù)絕對值或超基準值大小便可判斷有無H.pylori的感染。

大多數(shù)的研究表明，13C-UBT的敏感性和特異性高于IgG和糞便抗原檢測［8］。13C-UBT與RUT比較，敏感性的高低不一致，特異性上13C-UBT稍高［8］。

13C-UBT對于成人來講是一個可靠的診斷方法，但對于兒童其準確性隨年齡段不同而有變化。Leal等［9］將13C-UBT用于兒童的研究進行了系統(tǒng)回顧和Meta分析，結果表明，13C-UBT應用于＞6歲的兒童準確性較高、較穩(wěn)定［(敏感度96.6%，特異度97.7%，陽性似然比(positive likelihood ratio，LR+)42.6，陰性似然比(negative likelihood ratio，LR－)0.04，診斷比值比(diagnostic odds ratio，DOR)1042.7］;13C-UBT 應用于≤6歲的兒童中準確性有些變動并且低幾個百分點，尤其是特異度(敏感度95%，特異度93.5%，LR+11.7，LR－0.12，DOR 224.8)，但是準確性可以通過調整截斷值、檢測前進餐時間和尿素劑量來改善［9］。

Petrovic等［10］的實驗表明，以80%超基準值為標準，與組織學檢查法相比，14C-UBT敏感度94.5%、特異度100%、陽性預測值100%、陰性預測值96.3%、準確度97.8%。14CO2測試用的液體閃爍計數(shù)儀要比13CO2測試用的同位素質譜儀成本低，所以14C-UBT作為非侵入性的檢測方法經(jīng)常被用來測定兒童H.pylori的感染狀況。如李紅艷等［11］采用14C-UBT對武漢市3 368例兒童進行了H.pylori感染的臨床分析。

由于14C-UBT有輻射，所以患者經(jīng)常會有心理負擔。實際上，受檢者檢測1次所攝入37 kBq(1 muCi)的14C-尿素，不及受檢者1 d的自然本底照射劑量，而且?guī)缀跛袛z入的輻射量在72～120 h內都以尿和呼氣的形式排出體外，所以14C-UBT是安全的，無需擔心［12］。

5 抗體檢測

H.pylori進入人體后會產(chǎn)生特異性抗體，通過對特異性抗體的檢測可以間接證明病原菌的存在。目前已有很多成熟、便捷、效果較好的商品化H.pylori血清抗體檢測試劑或試劑盒，所用技術有酶聯(lián)免疫、化學發(fā)光酶免疫、膠體金免疫、免疫印跡等，所用抗原有重組蛋白、化學合成多肽等，步驟有一步的、多步的，功能有定性的、定量的，檢測的抗體有H.pylori-IgG、尿素酶抗體、CagA抗體、VacA抗體、鞭毛蛋白抗體、熱激蛋白抗體、外膜蛋白-67抗體等。如我國某公司2009年被批準生產(chǎn)的H.pylori尿素酶抗體檢測試劑盒，采用雙抗原夾心法免疫測定原理，結合膠體金免疫層析法即時檢驗技術，一步操作、肉眼觀察、10～20 min出結果，是一種適合人群H.pylori感染篩查的快速體外診斷試劑盒，在國內得到了廣泛的應用，如蔣斌［13］使用該試劑盒對2 998例健康體檢人群進行血清H.pylori尿素酶抗體進行檢測。

也有一些實驗室在嘗試建立新型抗體檢測方法，如Stege等［14］利用磁性納米珠作為H.pylori免疫親和配體的固化載體、毛細管電泳分離、激光誘導熒光檢測器檢測，建立了35 min內即可完成的全自動在線定量檢測H.pylori抗體的方法。

抗體檢測的樣本大多是血清或全血，但也有對其他樣本檢測的報道。Sonmezoglu等［15］用 ELISA來檢測唾液的H.pylori-IgG，敏感度、特異度分別為87%、73%。Nguyen等［16］用試劑盒 RAPIRUN來檢測尿液的H.pylori抗體，敏感度、特異度和準確度分別為79.5%、90.7%、84.5%。

6 糞便抗原檢測

糞便抗原檢測是一個方便、快捷、非侵入性、不需要特殊儀器，最重要的是取材方便的一種方法，尤其適用于小孩，近年來也獲得廣泛應用，如 Pourakbari等［17］用重組蛋白制備的兔抗烷基過氧化物還原酶(alkyl hydroperoxide reductase protein，AhpC)的多克隆抗體來檢測糞便中AhpC蛋白。

Leal等［18］對基于小孩糞便 H.pylori診斷的文獻做了系統(tǒng)回顧、Meta分析，結果表明單克隆抗體ELISA表現(xiàn)最好，敏感度97%、特異度97%、LR+29.9、LR－0.03;多克隆抗體ELISA次之，敏感度92%、特異度93%、LR+16.2、LR－0.09;單克隆抗體一步法檢測再次之，敏感度88%、特異度98%、LR+17.1、LR－0.18。

7 分子生物學方法

7.1 核酸雜交 核酸雜交是用32P、或生物素、或熒光物質等標記H.pylori特異性的核酸探針，經(jīng)過與生物樣本原位雜交或與吸附樣本DNA的膜雜交等程序來檢測H.pylori。該技術是PCR技術廣泛使用之前用的較多的一種分子生物學診斷方法，具有敏感性高和特異性強的優(yōu)點，但操作繁瑣。近年來的一個發(fā)展是用肽核酸來代替DNA作為基因的探針，因為肽核酸不僅具有核酸探針的功能，而且具有結構穩(wěn)定、不被核酸酶和蛋白酶降解的特點。如Cerqueira等［19］用肽核酸-熒光原位雜交來檢測懸浮培養(yǎng)的H.pylori的克拉霉素抗性，敏感度和特異度均為100%。

7.2 PCR方法 PCR方法測定 H.pylori的 DNA，具有簡便、快捷、靈敏度高和特異性強的特點，不需要完整的細菌活體存在，所以它不僅可以檢測胃的活檢標本，也可以測定胃液、糞便、牙菌斑、水等其他離體標本，而且樣品不需要嚴格的保存條件。所以PCR方法既適用于臨床檢測，又是流行病學調查的重要工具。隨機擴增多態(tài)性DNA技術(RAPD)是一項較早應用的PCR檢測技術，利用非細菌特異性的隨機短鏈引物擴增，產(chǎn)生高度特異的片段，根據(jù)這些片段的組成來檢測H.pylori。但這個方法首先要求培養(yǎng)分離出單一的菌株，增加了使用上的難度，所以以特定基因為目標的PCR技術更為常用，如普通PCR、Nested-PCR、Realtime PCR、PCR-RFLP等，作為擴增目標的特定基因有H.pylori的 RNA 基因(如 16S rRNA、5S rRNA、23S rRNA基因等)、尿素酶基因(如 ureA、ureB、ureC基因等)、VacA 基因、CagA 基因等。如 Kargar等［20］以 16S rRNA基因為目標的PCR來檢測H.pylori的感染，以23S rRNA基因為目標的Real-time PCR來檢測H.pylori的數(shù)量和克拉霉素抗性。CagA基因是一個重要的毒力因子，CagA陽性的菌株有更大的毒力，以該基因為目標的PCR可以對菌株毒力分型，如Saribas等［21］用PCR方法鑒定198個臨床積累的H.pylori菌株，58.6%為CagA基因陽性。

Rasmussen等［22］通過胃活檢、唾液和牙菌斑樣本PCR和Southern blot實驗表明，胃活檢樣本和口腔樣本的H.pylori陽性存在正相關關系。牙菌斑中會有很多親緣關系密切的細菌，所以目標基因和引物數(shù)量的選擇對結果會有重大影響，如果檢測時選擇兩個目標基因進行擴增就更為可靠［23］。

胃上皮細胞大約1～3 d會更新1次，脫落的上皮細胞會攜帶H.pylori-DNA隨糞便排出，所以可以用PCR方法來檢測。但是糞便含有Taq聚合酶的抑制劑-復合多糖［24］，難以從糞便中提取的DNA中徹底去除，使得相應的PCR檢測的靈敏度仍不高［18］。Horemans等［25］最近提出了一種從糞便中提取DNA的新方法，可以有效減少樣品DNA中混雜的復合多糖，即先用生物素標記的探針與糞便樣本中的目標DNA雜交，然后用鏈霉親和素包被的磁珠分離DNA，洗滌3次后可以直接用于普通或定量PCR檢測;以感染H.pylori的沙鼠糞便為樣本的實驗表明，該提取DNA的方法與作為對照的商業(yè)化的DNA提取試劑盒相比靈敏度提高了10倍。

8 其他新方法

Ulanowska等［26］用固相微萃取-氣質(SPME-GC/MS)分析發(fā)現(xiàn)，在H.pylori感染組所呼出的揮發(fā)性有機混合物(volatile organic compounds，VOCs)和懸浮培養(yǎng)的H.pylori所釋放的混合氣體中可以測到異丁烷、2-丁酮和乙酸乙酯等有機物，但在健康自愿者組所呼出的VOCs中檢測不到，該方法可能發(fā)展為一個非常有用的非侵入性的檢測方法。伏安生物傳感器也被用在了 H.pylori的檢測上［27］。

9 結語

綜上，H.pylori的檢測方法有很多，但各有優(yōu)缺點。一般來說，培養(yǎng)最為可靠，應看作是H.pylori診斷的金標準，但是敏感性差，需要一定的設備，技術要求高、費時長、不能及時報告，一般不作為常規(guī)診斷方法;組織學檢查也具有較高的診斷價值，但受H.pylori的灶性分布、取材、制片質量限制，容易出現(xiàn)假陰性，不適用于常規(guī)診斷;RUT實驗簡便、快捷、價格低廉，因而在臨床上是侵入性檢測中的首選方法，但非H.pylori尿素酶細菌可能造成假陽性［28］，H.pylori灶性分布及取材的限制可能造成假陰性;13/14C-UBT不需通過胃鏡取材，不受胃內H.pylori灶性分布的限制，是追蹤H.pylori治療效果的可靠標準，但非H.pylori尿素酶細菌可能造成假陽性，并且13C尿素呼氣試驗所需質譜儀較昂貴，難于普及，而14C由于其放射性，不易被兒童和孕婦接受;血清學檢測H.pylori抗體，不需通過內鏡取材，具有簡便、快速、結果重復性好、靈敏度高、特異性強、無需專用儀器和設備、成本低等優(yōu)點，適用于大批量的流行病學調查，但不宜作為療效判斷指標，因為H.pylori根除后抗體水平3個月才開始下降，6～12個月尚難消失;糞便抗原檢測也是一種較好的非侵入性檢測H.pylori的方法，并且不需要特殊儀器、操作簡便、耗時短、價廉、標本易于收集，在根除治療4～6 d后H.pylori從糞便中消失，所以可作為抗H.pylori治療后療效觀察的又一指標，但目前還未廣泛應用;PCR技術敏感性高、特異性好，適用于研究和臨床療效判別，但需要專門的儀器。具體選用哪種方法就需要結合方法的特點、現(xiàn)有條件和檢測目的等因素來選擇。

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Development of detectionMethodsfor Helicobacter pylori

SHAO Junli1，WU Feng2
1.School of Public Health，Guangdong Medical College，Dongguan 523808;2.Biology Group，Dongguan Middle School-SSL School，China

In this artical we are mainly from several aspects included culture，rapid urease test，histology examination，urea breath test，antibody detection，stool antigen test and molecular biological detection.The development of detectionMethodsfor Helicobacter pylori was reviewed briefly in recent years.

Helicobacter pylori;DetectionMethods;Rapid urease test;Urea breath test

R573

A

1006－5709(2012)08－0691－04

2012-03-25

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.002

廣東醫(yī)學院博士啟動基金項目(XB1012)

邵軍麗，博士，講師。E-mail:shaojunli421@yahoo.com.cn