宮頸癌患者外周血調節性B細胞亞群的檢測及臨床意義

摘 要 目的：檢測宮頸癌患者外周血調節性B細胞的數量以及血清中IL-10及TGF-β的表達水平，探討Br1在宮頸癌臨床監測中的意義。方法：收集50例宮頸癌患者外周血標本，用間接免疫熒光法檢測Br1細胞亞群的分布，用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中IL-10及TGF-β的表達情況。結果：宮頸癌患者外周血Br1的數量明顯高于正常對照組，IL-10的含量均明顯高于正常對照組（P＜0.05），宮頸癌浸潤組與正常對照組相比，Br1的數量及IL-10明顯升高（P＜0.05）。結論：宮頸癌患者中Br1的數量及血漿IL-10明顯升高，提示Br1細胞與宮頸癌的發生發展可能存在著一定的關系。

關鍵詞 宮頸癌 調節 B細胞

AbstractObjective:To detect the levels of Breg in PBMC and IL-10 and TGF-β expression in seria in cervical carcinoma patients，for evaluating the significance of Breg cells in cervical clinical monitoring.Methods:Br1 subsets in peripheral blood were detected by indirect immunofluorescent staining and the expression level of IL-10 and TGF-β were detected by ELISA in 50 cases with cervical carcinoma.Results:The proportion of Br1 increased in comparison with normal control（P＜0.05）.The expression levels of IL-10 expression in patients'seria were higher than those of control groups （P＜0.05）;the levels of plasma IL-10 were significantly higher in patients with infiltration as compared with patients with control groups（P＜0.05）.Conclusion:Predominant expression of IL-10 in cervical cancer patients suggests that Br1 cells may involve in the development of cervical cancer.

Key Wordscervical carcinoma;development;Breg

宮頸癌是最常見的婦科腫瘤之一，其確切的病因仍未明確。普遍認為，高危性人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，hrHPV）的感染是導致宮頸癌的主要原因之一^［1］。還有研究表明，宮頸癌的發生同時受其他因素影響，如患者細胞免疫功能低下^［2］。

新近研究提示，除分泌抗體的致病性B細胞外，還存在分泌IL-10或TGF-β等細胞因子的調節性B細胞（regulatory B cells，Bregs），分別稱為產生IL-10的Br1細胞或TGF-β1的Br3細胞^［3，4］。Bregs通過產生抑制性細胞因子或分泌抑制性抗體影響其他免疫細胞的功能，減緩炎癥癥狀。而慢性炎癥又是腫瘤的主要誘發因素^［5］，Br1細胞及其分泌的IL-10可存在于多種慢性炎癥疾病，表明Br1細胞參與慢性炎癥的病理機制。

為了深入探討Breg細胞亞型與宮頸癌的發生、發展之間的關系，本文針對不同病程的宮頸癌患者外周血Br1細胞亞群及血清中IL-10及TGF-β水平進行檢測，以期找到Breg細胞亞型在宮頸癌診斷、治療及預后中的作用。

資料與方法

主要試劑：兔抗人CD 5抗體（FITC）和CD 19抗體（PE）為Santa公司產品，IL-10及TGF-β的ELISA檢測試劑盒為北京達科為生物技術有限公司產品。淋巴細胞分層液為sigma產品。

臨床資料及標本：2007年12月～2010年12月宮頸癌患者外周血。所有患者術前均未做過放化療，患者年齡25～70歲，平均47歲。根據1995年FIGO修訂的臨床分期標準50例標本中Ia期5例，Ib期8例，Ⅱ a期13例，Ⅱb期20例，Ⅲ期4例。組織分化程度：高分化7例，中分化20例，低分化23例。取同期子宮肌瘤切除的正常宮頸25例作為正常對照。

實驗方法：間接免疫熒光法：外周血1ml，肝素抗凝。用淋巴細胞分層液分離單個核細胞，PBS洗2次，計數。取106個單個核細胞，分別加入抗CD 5抗體和抗CD 19抗體20μl，將標本與抗體充分混勻后，30溫育1小時。取出后用2ml紅細胞裂解液裂解10分鐘，離心后棄上清，用PBS洗2遍，上流式細胞儀做熒光檢測。

ELISA：常規收集血清，IL-10含量測定采用ELISA法，按試劑盒說明書操作，在450nm處讀取光密度值。

統計學處理：用EXCEL軟件處理數據，各計量資料以平均值±標準差表示，兩樣本均數的比較采用t檢驗；兩因素相關分析采用直線相關分析，檢驗水準α0.05，以P＜0.05為差異有顯著性。

結 果

宮頸癌患者外周血Br1亞群數量與疾病的關系：見表1，宮頸癌患者外周血中Br1亞群所占的比例增多，與正常對照組比較有統計學意義（P＜0.05）。分化程度越低，Br1的所占的比例就越多，中低分化的宮頸癌患者Br1亞群數量明顯高于高分化組（圖1-左）。并且隨著浸潤程度的增加，Br1的數量增加的越多（圖1-右）。

Br1細胞通過分泌IL-10抑制腫瘤患者的免疫功能：宮頸癌患者血清IL-10水平與分化程度呈負相關，分化程度越低，血清IL-10的水平越高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。表2可見，宮頸癌患者血清IL-10水平隨著浸潤程度的增加而增加，差異具統計學意義（P＜0.05）。而TGF-β的變化則沒有IL-10明顯，中低分化的宮頸癌患者雖然TGF-β有所增加，但是沒有統計學差異，也不隨分化程度及浸潤程度的變化而變化。見表1。

討 論

1996年，Janeway等^［6］首先報導了具有免疫調節功能的B細胞亞群，此類細胞與多種疾病，如風濕性關節炎（RA）、糖尿病、多發性硬化癥及腫瘤相關^［7，8］。Bregs主要經由炎癥反應誘導產生，以此抑制炎癥過度反應引起的組織損傷，加速機體恢復進程。Bregs可通過分泌細胞因子或抗體，也可通過直接或間接的作用，抑制炎癥反應的發生。而在腫瘤患者中，Bregs可通過抑制自身反應性T細胞抑制自身免疫，也可以通過抑制細胞毒T淋巴細胞活性減弱抗腫瘤免疫^［9］。

而我們的研究結果提示，在宮頸癌中，調節性B細胞亞群（Br1）的數量要比正常對照組多，說明該亞群反應了宮頸癌患者的免疫狀態。而通過ELISA方法檢測血清中與免疫抑制有關的免疫分子發現，血清中起主要抑制免疫作用的效應分子是IL-10而不是TGF-β，這從另一個角度證明在宮頸癌中調節性B細胞主要以Br 1亞群存在。

Inoue等研究表明，B細胞CD 40和腫瘤細胞CD 40L相互作用，可誘導B細胞產生IL-10，從而抑制CD 8+ T細胞的生物學活性，降低CD 8+ T細胞和NK細胞產生IFN-γ水平；B 細胞缺失可增加機體對腫瘤的原發性排斥^［9］。此外，B細胞產生的IL-10 可能與體外IFN-γ反應性降低有關。Bregs產生的IL-10可以抑制IL-6和IL-12在樹突狀細胞（DC）中的產生，從而進一步抑制TH 1和TH 17細胞的發育^［8-10］。Bregs能否像Tregs一樣代表獨立的調節性細胞以及調節機制仍有待進一步闡明。此外，負責Bregs調節細胞功能的信號轉導通路和相應的轉錄因子也需要進一步研究。

Bregs的發現及功能研究使特異性誘導/祛除Bregs，從而達到治療各種疾病如腫瘤、感染和自身免疫性病等疾病成為可能，但特異性祛除Bregs更能增強抗腫瘤免疫反應，似乎是更有前景的治療方法。但是，怎樣才能有效地特異祛除Bregs的方法還有待進一步研究。

參考文獻

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9 Inoue S，LeitnerWW，Golding B，et al.Inhibitory effects of B cells on antitumor immunity.Cancer Res，2006，66:7741-7747.

10 Sun C-M，Deriaud E，Leclerc C，et al.Upon TLR9 tignaling，CD5 + B Cells control the IL2122dependent Th12p riming capacity of neonatalDCs.Immunity，2005，22:467-477.

表1 IL-10及TGF-β在不同病理分化程度中的陽性表達

表2 IL-10及TGF-β在宮頸癌患者不同浸潤深度中的表達

圖1 宮頸癌患者中Br1的數量