CaMKIV在免疫細(xì)胞中的作用

基金項目：福建省自然科學(xué)基金（C0710017）

作者單位：350001 福建醫(yī)科大學(xué)附屬內(nèi)分泌研究所

通訊作者：游捷

【摘要】 鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）IV是Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的一個關(guān)鍵激酶，主要表達(dá)在神經(jīng)組織和免疫系統(tǒng)。研究表明，在經(jīng)過一系列級聯(lián)反應(yīng)激活后，CaMKIV轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CREB、MEF2及AP-1等活性，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育和激活，樹突狀細(xì)胞分化和存活，以及骨髓造血干細(xì)胞的維護(hù)。新近關(guān)于骨免疫學(xué)方面的研究顯示，CaMKIV參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，本文針對部分表達(dá)該蛋白的免疫細(xì)胞，探討CaMKIV在免疫炎癥中的作用。

【關(guān)鍵詞】 鈣調(diào)蛋白激酶IV； 炎癥反應(yīng)； T淋巴細(xì)胞； 樹突狀細(xì)胞

Ca²⁺是一個通用而普遍存在的第二信使，廣泛參與各種基礎(chǔ)細(xì)胞進(jìn)程，鈣調(diào)蛋白（CaM）是Ca²⁺的一個主要受體，在所有真核細(xì)胞中表達(dá)。Ca²⁺與CaM結(jié)合形成復(fù)合體，使得CaM內(nèi)部構(gòu)象改變，進(jìn)而可與許多不同靶酶相互作用，這些靶酶中較重要的是鈣調(diào)蛋白激酶（CaMKs）家族，包括磷酸化酶激酶、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、CaMKⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ^［1］。CaMKs家族目前研究較多的是CaMK Ⅱ和Ⅳ，主要在神經(jīng)組織和免疫系統(tǒng)。

1 CaMKIV概述

1.1 基因和蛋白 CaMKIV主要表達(dá)于腦組織和胸腺，脾臟、卵巢和睪丸也有少量表達(dá)。在免疫系統(tǒng)中表達(dá)于T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、造血干細(xì)胞，在B細(xì)胞及單核細(xì)胞中未見報道。編碼CaMKIV的基因由42 kb DNA組成，包括12個外顯子和11個內(nèi)含子，由于剪接差別和轉(zhuǎn)錄起始位點的不同，能夠產(chǎn)生多種mRNA。CaMKIV的分子量約為60 KDa，基本結(jié)構(gòu)包括一個N-末端激酶區(qū)域，一個自動調(diào)整區(qū)域和一個重疊的CaM結(jié)合區(qū)域。CaMKIV蛋白包括α、β兩種亞型，后者包含一個由28個氨基酸殘基組成的N-末端擴(kuò)展，其余結(jié)構(gòu)基本相同^［2］。

1.2 激活過程 在細(xì)胞質(zhì)中CaMKIV是一個由鈣調(diào)蛋白激酶激酶（CaMKK）和蛋白磷酸酶2A（PP2A）組成的復(fù)合體，是無活性的。當(dāng)胞內(nèi)Ca²⁺濃度增加時，部分Ca²⁺結(jié)合CaM，然后Ca²⁺/CaM復(fù)合物結(jié)合CaMKIV，由于Ca²⁺/CaM的結(jié)合位點與PP2A相同，故而取代PP2A，并且使得CaMKIV構(gòu)象改變，進(jìn)而使CaMKIV具備最基礎(chǔ)的激酶活性，暴露出可被CaMKK磷酸化的活性環(huán)。CaMKK磷酸化Thr²⁰⁰（在鼠類為Thr¹⁹⁶）位點，使CaMKIV完全激活，之后Ser¹²-Ser¹³位點自發(fā)磷酸化，稱為“自主激活”^［3］。只有自主激活的CaMKIV才能轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。此后，PP2A在細(xì)胞核內(nèi)重新結(jié)合CaMKIV，并使活性環(huán)上的蘇氨酸殘基去磷酸化。這種無活性的CaMKIV從細(xì)胞核進(jìn)入胞質(zhì)，完成一次活性循環(huán)，稱為級聯(lián)反應(yīng)^［4］。

1.3 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 在免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞內(nèi)CaMKIV大部分效應(yīng)與這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)有關(guān)，包括cAMP-反應(yīng)元件-結(jié)合蛋白（CREB）和它的輔激活因子CBP以及肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）。CREB是一種遍在而保守的轉(zhuǎn)錄因子，可結(jié)合相同的cAMP效應(yīng)元件（CRE），它的轉(zhuǎn)錄激活主要是通過S133位點的磷酸化來調(diào)節(jié)的，并使轉(zhuǎn)錄輔激活因子CBP募集。磷酸化的CREB-CBP復(fù)合物同基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)相互作用啟動RNA合成^［5］。MEF2存在于一些肌肉-特殊基因的啟動子中，最初被認(rèn)為是肌形成的一個主要調(diào)節(jié)者。Blaeser等^［6］研究表明，CaMKIV介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEF2，能激活T細(xì)胞Nur77啟動子。在靜止胸腺細(xì)胞，MEF2募集一個家族的轉(zhuǎn)錄抑制物，包括Cabin1和組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）-4、-5和-7。這些抑制物作為組蛋白脫乙酰基酶而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和沉默啟動子活性。Ca²⁺流入，Ca²⁺/CaM移走抑制物，使MEF2結(jié)合輔激活因子（如P300），進(jìn)而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄。

2 CaMKIV在T淋巴細(xì)胞中的作用

2.1 CaMKIV與T細(xì)胞發(fā)育 Krebs等^［7］研究顯示，CaMKIV在小鼠胸腺的胚胎發(fā)生過程中起調(diào)節(jié)作用。胚胎發(fā)育的前16 d CaMKIV存在于整個胸腺，第18天急劇增加，此時CaMKIV的水平與小狗出生后第一天的表達(dá)水平相當(dāng)。對小鼠胚胎的原位雜交研究顯示，在發(fā)育12.5 d前CaMKIV mRNA在胸腺原基的外圍高表達(dá)，13.5 d后定位模式變得彌散，但在胸腺內(nèi)可被檢測到，在胸腺發(fā)育的剩余時段則持續(xù)高表達(dá)，觀察到的信號與小狗出生后第一天的切片相當(dāng)^［8］。CaMKIV在成熟胸腺亞型中的表達(dá)各不相同，在胸腺細(xì)胞從CD4^-CD8^-的第一階段（DN1）分化至DN3的過程中CaMKIV表達(dá)不斷增加，在DP（CD4⁺CD8⁺）T細(xì)胞中，CaMKIV水平與細(xì)胞表面TCRαβ的表達(dá)相關(guān)，在大部分成熟DP細(xì)胞和SP（CD4⁺或CD8⁺）細(xì)胞中表達(dá)逐漸減少^［7］。

Anderson等^［9］發(fā)現(xiàn)無活性的CaMKIV在胸腺細(xì)胞中表達(dá)使得胸腺體積增大，細(xì)胞構(gòu)成增多，離體培養(yǎng)的存活率明顯下降。這種胸腺細(xì)胞在伊屋諾霉素和佛波酯十四烷酸刺激下不分泌IL-2及上調(diào)CD25的表達(dá)，原因可能與早期信號通路中CREB磷酸化顯著減少和早期快反應(yīng)基因表達(dá)等相關(guān)。在這些動物中，觀察到SP細(xì)胞百分率緩慢下降，伴隨著DP細(xì)胞平行增加，表明CaMKIV在DP細(xì)胞轉(zhuǎn)化為SP細(xì)胞的過程中起作用。這個現(xiàn)象可能是胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中CaMK級聯(lián)產(chǎn)生效應(yīng)的外在表現(xiàn)，因此CaMKIV可能是DP細(xì)胞選擇發(fā)育中信號機(jī)制的一個主要成分。這個研究揭示CaMKIV在DP細(xì)胞選擇發(fā)育過程中的一種特殊作用，并且在形成成熟胸腺細(xì)胞T細(xì)胞受體（TCR）的所有組成成分的過程中也起特定作用。

2.2 CaMKIV與T細(xì)胞的活化 Hanissian等^［10］通過TCR觸發(fā)誘導(dǎo)Ca²⁺依賴和自發(fā)激活的CaMKIV快速增加，緊接著快速返回至基線，說明這激活和失活循環(huán)是簡短且受緊密調(diào)控的。Yu等^［11］在鼠EL4胸腺瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，CD3和CD28介導(dǎo)的信號通過一種與CaMKIV有關(guān)的機(jī)制促進(jìn)CREB-CBP相互作用。在這個模型中CD28交聯(lián)激活CaMKIV，從而使CREB磷酸化和募集CBP。Park等^［12］提出，TCR刺激使CaMKIV的最大活化需要酶（包括CaMKK）的級聯(lián)。提供的直接證據(jù)就是克隆人和鼠CaMKKβ，并在Jurkat細(xì)胞的氨基酸T200中證明這種酶使CaMKIV磷酸化的能力，結(jié)果是CaMKIV的活性明顯增加。而且通過提高細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺含量CaMKKβ的活性也明顯增加。因此Park認(rèn)為CaMKK的激活比CaMKIV更需要Ca²⁺的高濃度或者一個不同的Ca²⁺庫。對Ca²⁺的不同需求能使CaMKIV通過Ca²⁺/CaM單獨在某種環(huán)境有選擇的短暫的活化，或者通過被CaMKK磷酸化應(yīng)答其它刺激信號而產(chǎn)生更強(qiáng)的激活。

IL-2對于初始T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增以及Treg細(xì)胞的增殖和存活都是非常重要的。IL-2基因的最大誘導(dǎo)需要可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AP-1。Ho等^［13］提出，CaMKIV通過一種涉及AP1的機(jī)制控制IL-2啟動子的活性，在成熟CD4⁺T細(xì)胞中起著控制CREB激活的作用。雖然在初始T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中，CaMKIV對于CREB的磷酸化和IL-2分泌的誘導(dǎo)都是可有可無的，但是在CD4記憶亞型T細(xì)胞的激活過程起著關(guān)鍵作用。Pan等^［14］發(fā)現(xiàn)MEF2在Jurkat細(xì)胞和一種鼠T細(xì)胞雜交瘤中調(diào)節(jié)IL2基因的轉(zhuǎn)錄。一個MEF2結(jié)合位點存在于IL2啟動子，接近TATA盒，這個元件在靜止性T細(xì)胞中被MEF2占有，起著調(diào)節(jié)Cabin1和組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）-4募集的作用。從IL-2啟動子中移動MEF2位點或通過siRNA減少MEF2的表達(dá)，導(dǎo)致IL-2轉(zhuǎn)錄的明顯減弱。Pan等^［15］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CaMKIV通過釋放Cabin1介導(dǎo)抑制MEF2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)IL-2啟動子中MEF2的轉(zhuǎn)錄活性。這是通過直接磷酸化Cabin1的C末端來為14-3-3產(chǎn)生一個停泊位點而實現(xiàn)的，14-3-3結(jié)合磷酰化Cabin1使核內(nèi)Cabin1輸出，使MEF2發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活功能。CaMKIV介導(dǎo)的Cabin1的核輸出可能是人T細(xì)胞激活過程所需要的一個重要部分。

3 CaMKIV與樹突狀細(xì)胞（DC）的存活

Illario等^［16］研究發(fā)現(xiàn)，在人單核衍生DC的分化過程中CaMKIV不斷蓄積，進(jìn)而控制著CREB磷酸化和Bcl-2（凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族，部分成員能抑制凋亡）蓄積。藥理抑制劑和無活性CaMKIV的異位表達(dá)，降低暴露在LPS中DC的生存能力。Camk4基因剔除小鼠的淋巴組織中DC數(shù)量減少，而且活體內(nèi)脾臟暴露于LPS中不能蓄積成熟DC。雖然離體camk4^-/- DC能夠獲得成熟細(xì)胞的表現(xiàn)型，在LPS刺激下也能釋放常規(guī)量的細(xì)胞因子，但是它不能蓄積pCREB、Bcl-2和Bcl-xL，因此不能存活。CaMKIV剔除小鼠中轉(zhuǎn)基因表達(dá)Bcl-2，在LPS刺激時DC存活能力完全恢復(fù)。TLR激動劑促進(jìn)DC存活主要是通過控制Bcl-2家族蛋白蓄積的時間，因此可以說Bcl-2是DC壽命和適應(yīng)性免疫應(yīng)答強(qiáng)度持續(xù)的“分子時鐘”^［17］。當(dāng)離體的DC激活“Bcl-2分子時鐘”，發(fā)生自發(fā)凋亡時，TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)信號修正BcL-2的丟失，并且延長已活化的DC的壽命^［16］。

4 CaMKIV級聯(lián)反應(yīng)在造血干細(xì)胞中的作用

Kitsos等^［18］研究顯示，CaMKIV在造血祖細(xì)胞及干細(xì)胞中表達(dá)，并且因為三種表面標(biāo)記的狀態(tài)（c-Kit⁺，Sca-1⁺，Lin^-/low）而稱為KLS細(xì)胞。Camk4^-/-小鼠的骨髓中僅含少量的KLS細(xì)胞并且功能缺陷，血液中白細(xì)胞含量也下降。KLS細(xì)胞數(shù)量降低可能與凋亡增加有關(guān)，而KLS細(xì)胞中缺乏CaMKIV與CREB S¹³³位點磷酸化降低相關(guān)。Camk4^-/- KLS細(xì)胞中數(shù)目下降的還有CREB結(jié)合蛋白CBP，說明CaMKIV對于KLS細(xì)胞中CREB/CBP通路的激活很重要，Bcl-2被認(rèn)為可能是CREB/CBP的一個下游靶點。在Camk4^-/-小鼠KLS細(xì)胞中，Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)下降，這在CaMKIV、磷酸化CREB、CBP和Bcl-2之間建立了一個清楚的關(guān)系。在Camk4^-/- KLS細(xì)胞中重新表達(dá)CaMKIV，能恢復(fù)磷酸化CREB、CBP及Bcl-2的表達(dá)水平。相似的，在Camk4^-/- KLS細(xì)胞中表達(dá)野生型CaMKIV，能糾正它們的增殖過度和凋亡異常。這些研究顯示CaMKIV在造血干細(xì)胞的維護(hù)中起著重要作用，也暗示在哺乳動物中阻斷這些酶可能有免疫抑制的作用^［2］。

5 問題與展望

綜上所述，這些有關(guān)CaMKIV的研究顯示，這條信號途徑廣泛參與免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答的各級進(jìn)程，與控制這些進(jìn)程的分子機(jī)制密切相關(guān)。新近研究顯示，CaMKIV通過控制破骨細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的分化存活，介導(dǎo)骨骼與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，與炎性骨疾病（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牙周病和骨髓炎）的發(fā)生密切相關(guān)^［19］。抑制CaMKIV能抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和輔刺激分子的表達(dá)，減緩有狼瘡傾向小鼠的疾病進(jìn)程^［20］。Sugiyama等^［21］發(fā)現(xiàn)CaMKIV的異常調(diào)節(jié)是高糖導(dǎo)致的胰腺β細(xì)胞功能缺陷的重要因素，CaMKIV還參與exendin-4誘導(dǎo)的GLUT2及GK基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響胰島素的分泌^{［22，23］}。因此，在免疫細(xì)胞中關(guān)于CaMKIV的研究帶來引人入勝的前景，將為這些免疫炎性疾病的防治提供新的思路。

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（收稿日期：2011-02-24）

（本文編輯：陳丹云）