MGMT在腎細胞癌中的研究

劉 剛， 關英華， 于江華， 王曉彬， 張明星， 竇中嶺， 梁 豪

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統腫瘤的常見病，發病率居第二位，僅次于膀胱癌，近年來，腎癌的發病率有上升趨勢，據美國文獻報道，自 1970年來，腎細胞癌發病率為 2.3% ～4.3%，且呈逐年遞增趨勢，導致每年有超過35 000例新增患者和12 000的死亡人數［1-2］，其中有60%的腎癌是偶然發現的［3］，而這些偶發癌大部分具有小腎癌和不易發生轉移的特點［4］。

腫瘤的發生與發展是一個多因素、多階段、長期相互作用的過程，與DNA損傷程度以及修復能力密切相關。人體的DNA長期暴露在理化因素的環境中(電離輻射和化學物質)以及異常代謝產物中(氧自由基)而遭受襲擊，引起DNA化學結構及其編碼特性的改變而致DNA損傷，這些損傷如果不能得到及時有效的修復，細胞的正常活動就會受到破壞，并由此誘發一系列的遺傳疾病乃至腫瘤的發生。DNA損傷修復是機體對DNA損傷所產生的重要生物學反應，其通過各種不同的損傷修復通路對DNA序列中損傷的、錯配的或不合適的堿基進行修復，以保證基因遺傳的穩定性［5］。

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)是自然界中各種生物體內普遍存在的一種獨特DNA修復酶。人類 MGMT基因定位于10 q26，為單肽結構，其cDNA長約769 bp，編碼207個氨基酸組成的蛋白質，含有5個外顯子和4個內含子，第4外顯子中的半胱氨酸殘基為烷基受體，是蛋白酶的活性部位。人MGMT基因穩定地存在于所有正常組織細胞內，多在具有分裂增殖能力的正常及癌變的胃、結腸靠近管腔側腺上皮細胞核內，研究結果提示其主要分布于活性基團轉錄的部位。MGMT是一種DNA修復酶，其主要作用是保護DNA免受烷化劑的損傷，從而阻止腫瘤的發生，而且有研究表明許多腫瘤的發生發展與MGMT缺失與突變關系密切［6-7］。

MGMT表達缺失或活性降低是否與腎細胞癌的發生發展機制有關，國內外報道甚少。因此，本研究采用免疫組織化學方法檢測80例腎細胞癌組織和30例癌旁組織及20例正常腎組織中MGMT的表達，探討MGMT表達的異常與腎細胞癌發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選取河南科技大學第一附屬醫院泌尿外科2009年1月—2011年1月間診斷明確的腎細胞癌手術切除標本80例，癌旁組織30例，另在河南科技大學法醫學院取正常腎組織20例。腎細胞癌患者中男62例，女18例，年齡35～80歲，平均63.3歲;腎細胞癌分期按2002年TNM分期系統(AJCC):T1+T262例、T3+T418例;分化程度按WHO1997分級法:高分化34例、中分化35例、低分化11例。所有標本均經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，連續組織切片，行免疫組織化學染色。

1.2 免疫組織化學染色 采用免疫組織化學(SP法)，鼠抗人MGMT單克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司，DAB顯色，蘇木素復染。用已知陽性標本切片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。

1.3 結果判斷 細胞核、細胞漿或兩者均出現棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性細胞數≥10%為陽性，陽性細胞數＜10%為陰性，結果的判讀由兩名高級病理診斷醫師審核。

1.4 統計學方法 所有數據經SPSS17.0軟件進行統計學分析處理，結果采用χ2檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 腎細胞癌、癌旁組織及腎正常組織的MGMT表達 MGMT在腎正常組織、癌旁組織及腎細胞癌中的陽性表達率依次為 65.0%、76.7%、32.5%，差異有統計學意義(P＜0.001)。

2.2 MGMT表達與腎細胞癌病理參數的關系MGMT在腎細胞癌中各個病理分級中的表達依次為高分化47.1%、中分化28.6%、低分化 9.1%，差異均有統計學意義(均P＜0.05);在各個臨床分期中依次為 T1+T248.6%、T3+T418.6%，差異有統計學意義(P＜0.05)。MGMT表達與患者性別、年齡、腫瘤數量、患病次數均無明顯相關性(P＞0.05)，詳見表1。

3 討論

腎細胞癌的發生與發展是多個因素參與的復雜的過程，與多種癌基因和抑癌基因的表達、調控以及細胞凋亡有關［8］。傳統的觀點認為腫瘤的發生通常是基因損傷累積的結果，隨著研究的進展，國內外許多學者又發現基因啟動子異常甲基化和腫瘤的發生關系密切，而基因啟動子非甲基化正常狀態的維持則是靠甲基化轉移酶的作用來實現。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)是從細菌到哺乳類動物機體中存在的一種獨特DNA修復酶，其同時發揮轉移酶與甲基接受體的作用，在DNA交聯形成前將烷化基團從O6-mG的O6位轉移到自身半胱氨酸殘基上，使 DNA鏈上的鳥嘌呤損傷修復，同時MGMT在轉甲基后不可逆地失去活性。MGMT是體內唯一可以去除這種甲基化損傷的DNA修復酶［9］，其可將O6鳥嘌呤加合物從DNA上移除，阻止腫瘤的發生。MGMT不僅在保護細胞免受烷基類物質的毒性、突變性和致癌活性中具有決定性作用，同時也維持了其他抑癌基因的功能。Virmani等［10］通過研究發現MGMT啟動子甲基化程度與宮頸病變發展程度一致。Allay等［11］發現MGMT過度表達能明顯降低淋巴瘤的發生率。Eads等［12］研究發現Barrett食管發展到腺癌與MGMT甲基化關系密切。Park等［13］研究發現胃癌MGMT啟動子甲基化與淋巴結轉移、腫瘤分級以及生存期有明顯相關性。

表1 MGMT表達與腎細胞癌病理參數的關系

我們采用免疫組化SP法研究MGMT在20例正常腎組織、30例癌旁組織及80例腎細胞癌中的表達，結果顯示MGMT在正常腎組織中的陽性表達率為65.0%(13/20)，在癌旁組織中的陽性表達率為76.7%(23/30)，在腎細胞癌中的陽性表達率為32.5%(26/80)，差異有統計學意義(P=0.000)。而且主要表達于細胞漿或細胞核，表明MGMT的低表達可能與腎細胞癌由正常組織發展而來的過程有關，在胞漿或胞核中起作用。

本組結果MGMT在腎細胞癌中的表達明顯低于正常腎組織和癌旁組織，癌組織中的DNA損傷不能得到及時有效地修復，表明MGMT表達水平降低在腎正常組織逐漸演變為腎細胞癌的過程中起到了促進作用，這也與大多數學者的研究結果一致，MGMT可以作為檢測腎細胞癌的腫瘤指標之一。

本組結果還顯示MGMT的陽性表達與腎細胞癌的分化程度顯著相關(高、中、低分化分別為47.1%、28.6%、9.1%)(P ＜ 0.05)，與臨床分期也顯著相關(T1+T248.6%、T3+T418.6%)(P ＜0.05);與患者性別、年齡無明顯相關性(P＞0.05)。

MGMT蛋白由O6-烷化鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶介導，在不需要任何輔助因子或其他蛋白質的條件下，特異性地對由致癌劑亞硝酸鹽類引起的胞嘧啶O4或鳥嘌呤O6位上的化學加合物起作用，可以催化DNA分子中胞嘧啶O4或鳥嘌呤O6位上的甲基、二氯乙基等一大類烷化基，使其轉移至自身肽鏈145位的半胱氨酸殘基上使他們失活，使DNA鏈上鳥嘌呤損傷修復，恢復DNA原來的化學結構、狀態和功能的完整性。大量資料表明，MGMT含量與腫瘤發生呈明顯負相關，而MGMT甲基化在腫瘤的發生與發展中擔負重要作用。Cooper等［14］研究顯示，MGMT的表達減少與肺癌的發生及轉移明顯相關，而且更易發生在伴有轉移的晚期肺癌的患者中。

在本實驗中，MGMT在腎細胞癌中表達與其病理組織學分級呈負相關，即腫瘤的惡性程度越高而MGMT的表達越低，提示組織細胞中MGMT含量降低后，更多的DNA損傷沒有得到及時有效修復。Zhou等［15］研究發現，組織細胞內MGMT表達缺失或活性降低會使DNA損傷不能得到及時修復從而導致基因突變不斷累積，增加細胞癌變機率。由此我們可以推斷，當檢測到腫瘤組織中MGMT表達明顯降低時即可認為腫瘤的惡性程度較高，檢測MGMT可作為診斷腎細胞癌的指標之一。MGMT在腎細胞癌中表達水平與其臨床分期也呈負相關，即T3+T4中表達明顯低于T1+T2，提示MGMT低表達則預示著腎細胞癌的臨床分期進展較高，其可以作為判斷腎細胞癌預后的指標，并為臨床治療腎細胞癌提供一定的指導作用。

MGMT蛋白的表達可能成為一種預判RCC預后的重要腫瘤標記物，從而指導臨床治療方案的選擇。但是國內外對MGMT在腎細胞癌研究甚少，確切發病機制還不是十分清楚，本次研究收集的標本數量也不夠充分，這將是我們下一步的研究方向。

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