VIP在慢性便秘大鼠結腸肌間神經叢中的表達和意義

杜麗娟 唐學貴 吳至久 李 敏

川北醫學院附屬醫院,四川省南充市 637000

慢傳輸型便秘的確切病因、發病機制和病理生理的改變現尚未完全明了,目前一系列研究表明,一些胃腸激素血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、5-羥色胺、胃泌素、生長抑素等分泌異常可能與慢性便秘的發病相關[1]。其中血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)作為胃腸動力抑制性神經元,具有松弛胃腸道平滑肌、抑制胃腸蠕動的作用。因此,筆者為了解腸神經遞質與慢性便秘之間的關系,選取慢性便秘大鼠模型為研究對象,采用免疫組化技術,檢測VIP在慢傳輸型便秘大鼠模型結腸肌間神經叢的蛋白表達情況,探討其在慢性便秘發病機制中的作用,期望為臨床治療方案選擇提供相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 60只健康SD大鼠,清潔級,雌雄各半,體重180～250g(川北醫學院動物實驗中心提供),將動物隨機分為正常對照組、慢性便秘模型組,每組30只。

1.2 動物模型建立 參照文獻[2]制作大鼠慢性便秘動物模型的方法,并加以改進,將配好的含復方地芬諾酯10mg/kg混懸液4ml灌胃,1次/d,連續灌胃14d,建立大鼠慢傳輸型便秘模型。正常對照組則以等量生理鹽水替代復方地芬諾酯進行灌胃。

1.3 主要藥物及試劑 復方地芬諾酯(江蘇平光制藥有限責任公司);大鼠VIP一抗免疫組化試劑盒(北京博奧森生物有限公司)。

1.4 標本制備 兩組大鼠均于末次灌胃后24h,頸椎脫臼法處死,剖腹找到盲腸,剪取近端結腸8～10mm,用4℃生理鹽水沖凈腸內容物及血液,放入4%多聚甲醛中固定,用于免疫組織化學檢測。

1.5 結腸肌間神經叢VIP蛋白的免疫組織化學檢測 SP法：組織石蠟切片脫臘,3%H2O2、37℃孵育,PBS沖洗,滴加10%正常山羊血清封閉液孵育,加入一抗為兔抗大鼠抗體(1∶100稀釋)孵育,PBS沖洗,滴加二抗為生物素標記的山羊抗兔IgG孵育,PBS沖洗,滴加試劑辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/H RP)孵育,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木精復染,中性樹膠封片。陽性細胞胞漿呈棕褐色。

1.6 結果判定 所有切片均設置陰性對照(不加一抗染色,PBS代替一抗)。免疫組織化學陽性標準：棕褐色染色為陽性表達。隨機選取5個高倍視野×400,以顯微圖像分析系統Image-Proplus 6.0進行圖像分析處理測定MD值。

2 結果

2.1 VIP在兩組大鼠結腸肌間神經叢表達結果主要表達于結腸肌間神經叢神經元細胞胞漿。VIP在正常對照組大鼠結腸黏膜層及肌間神經叢神經元的胞漿表達呈棕褐色,分布稀疏。與正常對照組相比,模型組大鼠結腸黏膜層及肌間神經叢神經元表達同樣也呈棕褐色,但分布較密集,細胞陽性表達染色升高,見圖1。

圖1 正常對照組與模型組免疫組化VIP表達(×400),A：正常對照組 B：模型組

2.2 兩組大鼠MD值比較 兩組大鼠結腸肌間神經叢組織VIP蛋白檢測結果顯示,慢性便秘模型組大鼠肌間神經叢組織V IP蛋白平均光密度值顯著高于正常對照組(P＜0.05),見表1。

表1 正常對照組與模型組免疫組化VIP表達平均光密度值(MD)比較()

表1 正常對照組與模型組免疫組化VIP表達平均光密度值(MD)比較()

注：*與正常對照組相比,差異有統計學意義P＜0.05。

分組 例數 VIP正常對照組 30 0.077±0.044模型組 30 0.223±0.025*

3 討論

慢性便秘主要是以大便排出困難、排便次數少及排便時間延長為主要癥狀,因為其病因和發病機制目前尚不明確,所以臨床治療效果并不理想[3,4]。近年來研究發現腸神經系統和腸神經遞質參與了腸道運動功能的調節,且逐漸成為研究慢性便秘發病機制的熱點。

血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,V IP)屬于胰高血糖素-胰泌素家族,是腸神經系統中的一種主要的抑制性神經遞質,VIP的分泌細胞廣泛存在于整個胃腸道,其主要作用是增強胃腸黏膜的腺體分泌、松弛胃腸道平滑肌、抑制胃腸蠕動。國內外實驗證實V IP是胃腸道重要的神經遞質,其分布異常可能與在慢性便秘的發病機制有關[5～7]。筆者研究觀察到VIP陽性表達物主要定位于肌間神經叢神經元的胞漿,呈棕褐色,且在慢傳輸型便秘模型大鼠的結腸肌間神經叢中表達增強,提示VIP與慢傳輸型便秘的發病機制相關,VIP作為腸神經系統抑制性神經遞質,其水平增高可以抑制胃腸道平滑肌收縮及腸肌緊張性,減少胃腸黏膜的分泌活動,從而抑制腸蠕動導致慢性便秘。故理論上可以在臨床上選用或研發能夠減少腸道VIP的釋放的藥物,降低腸道VIP水平,促進胃腸道蠕動,從而達到治療慢性便秘的目的。

[1]劉謙民,令狐恩強,劉運祥,等.功能性胃腸病學〔M〕.北京：人民軍醫出版社,2003：333-354.

[2]萬錦州,馬錦星,劉卉.一種簡易的小鼠便秘模型〔J〕.中國藥理學通報,1994,10(1)：71.

[3]劉寶華.便秘的診斷與治療〔M〕.第2版.北京：軍事醫學科學出版社,2003：165-166.

[4]柯美云,羅金燕,許國銘,等.慢性便秘的診治指南〔J〕.中華內科雜志,2004,43(1)：73-74.

[5]Cortesini C,Cianchi F,Infantino A,et al.Nitric oxide synthase and VIP distribution in enteric nervous system in idiopathic chronic constipation〔J〕.Dig Dis Sci,1995,40(11)：2450-2455.

[6]Tomita R.Regulation of the peptidergic nerves(substance P and vasoactive intestinal peptide)in the colon of women patients with slow transit constipation：an in vitro study〔J〕.Hepatogastroenterology,2008,83(1)：500-507.

[7]丁義江,哈楠林,丁曙晴.結腸慢傳輸型便秘與突觸素和p物質及血管活性腸肽的臨床研究〔J〕.中華胃腸外科雜志,2004,7(6)：485-487.