滋腎方對癡呆模型大鼠學習記憶能力的影響*

韓 琴，趙玉霞

(天津市海河醫院，天津 300350)

隨著社會人口老齡化，老年癡呆越來越引起人們的關注。其中老年性癡呆(Alzheimer’s disease， AD)是最常見的一種類型。AD的主要特征性病理學改變是大腦萎縮、腦組織內大量老年斑(senile plaque，SP)形成、大腦皮層和皮層下結構細胞內神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)及腦實質血管淀粉樣變性[1，2]。已有實驗結果證實，滋腎中藥對老年性癡呆模型大鼠神經細胞具有保護作用[3-6]。推測可能與該組方抑制細胞凋亡有關。本實驗通過建立D-半乳糖所致亞急性衰老合并鵝膏蕈氨酸化學損毀Meynert核(邁耐特核)所致接近老年癡呆癥的癡呆復合動物模型，并觀察滋腎方對癡呆大鼠行為學和學習記憶的影響，為抗老年癡呆新藥滋腎方的開發以及進入臨床試驗階段提供實驗資料和科學依據。

1 試藥與動物

滋腎方：由天門冬、山萸肉、熟地、龜板、黃精等中藥組成，中藥飲片由天津市海河醫院中藥房提供。健康Wistar雄性大鼠，鼠齡9～10周，體重300～350 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物試驗中心提供。鵝膏蕈氨酸(ibotenic acid，IA)，SIGMA公司生產。氨基甲酸乙酯(urethane)，中國醫藥公司上海化學試劑公司生產。D-半乳糖(D-galactose)，FARCO CHEMICAL SUPPLIES。MG-2型迷宮，江蘇省張家港市生物醫學儀器廠制造。江灣Ⅰ型立體定位儀，上海花木農機廠制造。

2 方法與結果

2.1分組及模型的制備 將Wistar大鼠30只隨機分為空白對照組、癡呆模型組和癡呆模型滋腎方組，每組10只。予癡呆模型組和癡呆模型滋腎方組大鼠腹腔注射10%D-半乳糖，50 mg/kg·d-1，予空白對照組大鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續給藥4周。將5 μg的鵝膏蕈氨酸溶于1 μl的0.2 mol/L 、pH 7.4磷酸緩沖液(NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O)中待用。將癡呆模型組、癡呆模型滋腎方組大鼠進行化學損毀Meynert基底核手術。方法為將上述兩組大鼠經25%氨基甲酸乙酯(4 ml/kg)腹腔麻醉后，固定于江灣Ⅰ型立體定位儀上，剪去頭部鼠毛，以碘酊和75%酒精常規消毒手術區皮膚，沿顱中線縱向切開約2～3 cm，剝開皮下筋膜暴露顱骨，用棉球分離骨膜，暴露出十字縫和人字縫。移動立體定位儀上下標尺，調整大鼠頭部平面，使十字縫比人字縫寬1.5 mm。參照大鼠腦立體定位圖譜[4]，按定位坐標AP 1.4 mm，ML 2.4 mm，DV 7.4 mm，鉆開顱骨。用微量進樣器在鉆孔處垂直進針，然后以0.2 μl/min 的給藥速度緩慢注入配好的IA溶液，持續給藥5 min，留針5 min，以利于藥液吸收，并防止擴散[8、9]。同樣方法損毀另一側Meynert核。術后用牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚。

2.2滋腎方的煎制及給藥方法 將中藥滋腎方各藥材置于藥鍋內，加相當于藥材質量7倍的冷蒸餾水，浸泡2 h，煮沸30 min，過濾。藥渣加5倍量蒸餾水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成1 g/ml生藥藥液[7，8]。造模后7 d給予大鼠藥物治療，癡呆模型滋腎方組按生藥5.2 g/kg·d-1，灌胃，連續給藥20 d；空白對照組和癡呆模型組的大鼠給予等劑量的生理鹽水。

2.3電迷路法測試大鼠學習記憶能力 大鼠學習記憶測定在Y型迷宮(Maze)箱中進行。該裝置分成三等分，分別稱之為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂。每臂長為30 cm、高為15 cm、寬為12 cm。箱底鋪設直徑為3 mm的銅柵，銅柵間距為7 mm，可通以脈沖電流，電壓60 V，延遲時間為5 s，每臂頂端裝有15 W信號燈，燈光示為安全區，不通電。如以Ⅰ臂為起步區，則Ⅱ臂為安全區，Ⅲ臂為電擊區。訓練時在安靜的暗室中，讓大鼠在暗室中適應30 min后開始訓練[9]。將大鼠放入起步區適應3 min，操縱迷宮刺激器，按順時針方向改變安全區方向給予燈光信號。在大鼠受電擊后從起步區直接逃避至安全區為正確反應，否則為錯誤反應。燈光持續亮15s后熄燈，結束一次訓練，休息60 s。此時該安全區作為下一次訓練的起步點，順時針給予燈光刺激，待其逃避至安全區[10]。學習48 h后進行記憶測試。大鼠的學習記憶成績以滿分100分計算，每錯一次減2.5分[11]。

2.4統計學處理 采用SPSS 11.0進行數據分析。藥物治療前后學習記憶成績的比較采用配對t檢驗法。α=0.05，雙側檢驗。

2.5結果

造模后大鼠的學習成績與記憶成績均低于造模前，給予滋腎方后學習記憶成績明顯高于給藥前，差別有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 滋腎方對癡呆模型大鼠學習和記憶成績影響 分

3 討論

AD作為老年人癡呆的一種特殊類型越來越受到人們的關注。祖國醫學認為，腎與腦緊密相關，腎虛是衰老的基礎，是許多老年性疾病發生的主要原因，若腎虧髓枯，腦失所養，則出現記憶、智能、精神等方面的障礙，進而影響全身的生理功能。針對AD腎精不足，氣血虧虛，痰凝血瘀的病機，根據中醫基本理論，經科學組方，提出了滋腎方。

本實驗采用D-半乳糖所致亞急性衰老合并鵝膏蕈氨酸化學損毀Meynert核所致復合癡呆動物模型，觀察和分析滋腎方對大鼠學習記憶能力的影響。

結果表明：造模后大鼠的學習成績與記憶成績均低于造模前，給予滋腎方煎劑灌胃治療20 d后，行為學測試數據表明，中藥滋腎方可明顯改善癡呆大鼠的學習和記憶障礙，學習和記憶成績明顯提高，與治療前比較差別有顯著性，具有統計學意義(P<0.01)。

中藥滋腎方作為一種新的治療手段，其具有更為廣闊的發展前景。

1 David M A Mann,田金洲,時晶,等.阿爾茨海默病患者腦淀粉樣血管病變.中華老年醫學雜志,2003,22(11):708

2 Cacabelos R. The application of functional genomics to Alzheimer’s disease. Pharmcaogenomics，2003,4(5):597

3 何明大,劉運林.腦靈湯對阿爾茨海默病模型鼠調亡調控基因的影響.中國現代醫學雜志,2005,15(22):3398

4 Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Sydney: Academic Press, 1988：17

5 馬滌輝,劉曉亮,張昱,等.實驗性Alzheimer模型鼠腦組織5-羥色胺含量改變的研究.中風與神經疾病雜志,1996,13(3):150

6 李亞明,張春燕,林水淼.調心方對D-半乳糖合鵝膏蕈氨酸致癡呆大鼠學習記憶、腦磷酸化tau蛋白水平的影響.黑龍江中醫藥,2000,3:52.

7 李儀奎主編.中藥藥理實驗.上海:上海科學技術出版社,1991:36,171

8 皮明鈞,劉鶯,陳力,等.加味溫膽湯對亞急性衰老大鼠血GSH-Px及肝、腦MAO、LPF的影響.中國中醫基礎醫學雜志,1999,5(2):14

9 尹兆寶,王健,楊新平,等.D-半乳糖誘導擬衰老動物模型的記憶行為改變.中國老年學雜志,2000,20(1),33

10 徐叔云,卞如濂,陳修主編.藥理實驗方法學.北京:人民衛生出版社,2002:179-181,202-204,769-772,826

11 任汝靜,陳生弟.阿爾茨海默病的治療現狀和展望.中國現代神經病學雜志,2005,5(3): 147