單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂固體脂質(zhì)納米粒的制備方法及性質(zhì)考查*

佟若菲，朱雪瑜

(1.天津市兒童醫(yī)院，天津 300074； 2.天津藥物研究院，天津300193)

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside，GM1)是含唾液酸的糖神經(jīng)鞘脂，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的組成成分，對(duì)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、軸漿運(yùn)輸和再生均起到重要的生理作用。

目前，GM1在臨床上已被廣泛用于治療各種創(chuàng)傷性和心腦血管疾病的神經(jīng)損傷[1]及各種慢性病后期的神經(jīng)功能障礙、腦萎縮、阿爾茲海默病、智力障礙[2,3]等。為提高GM1在體內(nèi)的生物利用度，同時(shí)能夠更快速地進(jìn)入腦組織中，并且解決臨床應(yīng)用劑型的穩(wěn)定性，從而更有效地治療急慢性中樞神經(jīng)損傷，現(xiàn)嘗試將GM1制備成固體脂質(zhì)納米粒(SLN)，并可進(jìn)一步開發(fā)粉針劑型，方便臨床使用。

1 材料與儀器

GM1(自豬腦中提取，自產(chǎn)，純度為95%)；大豆卵磷脂(四川英格爾公司，批號(hào)為20100306)；硬脂酸(浙江物美化學(xué)品有限公司，批號(hào)為20101024)；泊洛沙姆F-68(南京威爾化工有限公司, 批號(hào)為20100822)；硬脂酸聚烴氧酯S-40(遼寧奧克化學(xué)集團(tuán)有限公司, 批號(hào)為20100917)；甘露醇(青島明月海藻集團(tuán)有限公司, 批號(hào)為360902001)；雙蒸水(自制)；藥用西林瓶[雙峰格雷斯海姆醫(yī)藥玻璃(丹陽)有限公司]。以上原料及輔料均為藥用級(jí)。攪拌加熱套(型號(hào)HWCL-G)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)R202-2A)；高壓乳勻機(jī)(型號(hào)NS1001L)；冷凍干燥機(jī)(型號(hào)LGJ-25C)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶劑乳化法 將10 mg GM1和100 mg硬脂酸溶于氯仿中，200 mg大豆卵磷脂溶于適量乙醇中，兩部分混合即成有機(jī)相，水浴加熱至75 ℃。將200 mg泊洛沙姆F-68溶于雙蒸水，即為水相，該水相放在攪拌加熱套上，加入磁子進(jìn)行攪拌并加熱至75 ℃，保持恒溫。用膠頭滴管將有機(jī)相逐滴加入水相中，恒溫?cái)嚢柚列纬赏该黧w系。將該體系轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，并濃縮至總體積的1/2。將濃縮液快速加入0℃水相中，快速攪拌降溫2 h，形成GM1固體脂質(zhì)納米粒(GM1-SLN)的混懸液。

2.2高壓乳勻法 稱取50 mg硬脂酸、30 mg大豆卵磷脂，加熱到75 ℃，充分?jǐn)嚢杌靹颢@得液態(tài)油相。稱取10 mg GM1加入到液態(tài)油相中，充分?jǐn)嚢柚脸吻寰鶆颉７Q取250 mg硬脂酸聚烴氧酯S-40，加入50 ml雙蒸水，置攪拌加熱套上加熱并恒溫于75 ℃即為水相。用膠頭滴管將75 ℃的含GM1的澄清溶液逐滴加入到水相中，同時(shí)采用磁子進(jìn)行攪拌。混合均勻后采用高壓乳勻機(jī)乳化5 min，冷卻至室溫即得GM1-SLN混懸液。

2.3注射用凍干粉針劑的制備 將經(jīng)兩種方法獲得的GM1-SLN混懸液分別加入適量雙蒸水，使體積為500 ml，加入一定質(zhì)量的甘露醇使其終濃度為3%，分裝于5 ml藥用西林瓶中，置于冷凍干燥機(jī)中-40 ℃預(yù)冷，設(shè)定凍干程序，觀察凍干過程中的狀態(tài)，直到獲得白色疏松狀粉末。

2.4結(jié)果

2.4.1納米粒外觀及穩(wěn)定性觀察 制得的GM1-SLN為乳白色混懸液。取兩種方法制備得到的GM1-SLN的混懸液樣本各10份，其中5份放置于室溫，另外5份放置于4 ℃冰箱內(nèi)，放置24 h、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月觀察其外觀，發(fā)現(xiàn)無外觀變化；然后以4 000、5 000、10 000和15 000 r/min進(jìn)行常溫高速離心10 min，無沉淀和分層現(xiàn)象發(fā)生。

2.4.2納米粒形態(tài)學(xué)考查[4]取兩種方法制得的GM1-SLN混懸液適量，加雙蒸水稀釋，然后滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，以2%的磷鎢酸鈉液負(fù)染，在透射電鏡下照片，見圖1。照片顯示，納米粒呈類球形，分散狀態(tài)良好，溶劑乳化法和高壓乳勻法算術(shù)平均粒徑分別為108和90 nm。

2.4.3納米粒包封率考查 取兩種方法制得的GM1-SLN混懸液適量置離心管中，100 000 r/min離心15 min，吸取上清，用蒸餾水補(bǔ)足體積，再次以100 000 r/min離心15 min，吸取上清。合并兩次上清，用HPLC法測(cè)定其中GM1含量[5]計(jì)為M1；精密量取GM1-SLN 10 ml，置于50 ml量瓶中，加雙蒸水定容至刻度，搖勻，超聲后，3 500 r/min離心3 min，取上清液進(jìn)樣測(cè)定GM1含量計(jì)為M0。按下式計(jì)算溶劑乳化法和高壓乳勻法包封率[6]分別為87.31%和95.28%，見表1。其中：包封率=(1-M1/M0)×100%。

溶劑乳化法 高壓乳勻法

表1 兩種不同方法的包封率比較(n=3)

2.4.4注射用凍干粉針劑性狀 由溶劑乳化法制得的GM1固體脂質(zhì)納米粒經(jīng)凍干后有明顯分層顯現(xiàn)，凍形不佳，且松散，極易破碎。經(jīng)高壓乳勻法制得的GM1固體脂質(zhì)納米粒經(jīng)凍干后凍干粉呈均勻白色，且無分層顯現(xiàn)，具備一定固體力度，且復(fù)溶性好。

3 討論

GM1分子是由一個(gè)疏水的神經(jīng)酰胺部分和親水的唾液酸寡糖基團(tuán)組成，分子量為1 574 D。GM1具有促進(jìn)神經(jīng)重構(gòu)，加速神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)；促進(jìn)神經(jīng)再生，促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)和突觸形成；恢復(fù)神經(jīng)支配功能，改善神經(jīng)傳導(dǎo)，促進(jìn)腦電活動(dòng)及其他神經(jīng)電生理指標(biāo)的恢復(fù)；保護(hù)腦細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞膜各種酶活性恢復(fù)等功能。

外源性GM1具有脂溶性，試驗(yàn)證明進(jìn)入體內(nèi)后可以穿過血腦屏障，聚集于受損腦區(qū)，嵌入細(xì)胞膜內(nèi)，模仿內(nèi)源性GM1的功能發(fā)揮作用。外源性GM1一般從牛腦或豬腦中提取獲得，臨床目前應(yīng)用的為進(jìn)口注射水針劑型。雖然GM1可以進(jìn)入腦組織，但是通過對(duì)GM1的藥物動(dòng)力學(xué)研究證明，外源性GM1注射到動(dòng)物體內(nèi)后，大量聚集在肝內(nèi)，僅有20%進(jìn)入腦、脊髓、腎臟等臟器，并且血清半衰期較短，進(jìn)入體內(nèi)的藥物僅有少量發(fā)揮作用，使用效率低，在臨床上為了達(dá)到治療效果通常用量較大，因而有必要通過相應(yīng)方法提高GM1的生物利用度。

SLN是近年正在發(fā)展的一種新型毫微粒類給藥系統(tǒng)，是指以生物相容的高熔點(diǎn)脂質(zhì)為骨架材料制成的納米球，以固態(tài)的天然或合成類脂將藥物包裹于類脂核中制成粒徑為50～1 000 nm的固體膠粒給藥體系。由于骨架材料在室溫時(shí)是固體，故SLN既具有聚合物納米球的物理穩(wěn)定性高、藥物泄漏少、緩釋性好、性質(zhì)穩(wěn)定、制備簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，又兼有脂質(zhì)體毒性低、易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[7]。常用的高熔點(diǎn)脂質(zhì)有飽和脂肪酸甘油酯、硬脂酸、混合脂質(zhì)等。SLN與以磷脂為主要成分的脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)不同，是由多種類脂材料形成的固體顆粒，其同時(shí)具有一定的緩釋作用，可以作為靶向定位和控釋作用的載體。SLN為一種在藥學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出很好應(yīng)用前景的藥物載體，并且已經(jīng)應(yīng)用于臨床。本實(shí)驗(yàn)分別采用溶劑乳化法和高壓乳勻法制備GM1固體脂質(zhì)納米粒，并將制備結(jié)果進(jìn)行比較。

通過以上兩種方法比較，高壓乳勻法較溶劑乳化法不僅收率、包封率高，且初步凍干粉性狀亦更符合凍干粉針劑的藥品標(biāo)準(zhǔn)要求，因而推測(cè)可作為GM1臨床注射用凍干粉針劑的制備的方法。為獲得臨床生物利用度高，且能安全有效到達(dá)治療位點(diǎn)的GM1臨床劑型，下一步工作將針對(duì)高壓乳勻法進(jìn)行更深入的研究。

1 劉衛(wèi)東，蔣萬書，黃光富，等. 神經(jīng)節(jié)苷脂 GM1對(duì)彌漫性軸索損傷療效的臨床觀察.中國(guó)臨床外科雜志，2002，7(6)：341

2 水濤，張國(guó)哲，張賽，等. GM1添加治療重型顱腦創(chuàng)傷的臨床觀察. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2004，3(1)：35

3 李昭杰，周東，舒航.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)急性顱腦損傷應(yīng)用價(jià)值的臨床觀察.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001，21(7)：417

4 劉鐵根，張凡，孟卓.納米粒子大小及其分布檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀與發(fā)展.光學(xué)技術(shù)，2005，31(1)：96

5 劉勤，謝劍煒.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)昔脂鈉雜質(zhì)檢查及含量測(cè)定方法的研究.藥物分析雜志，2005，25(2)：153

6 劉玉梅，朱昆，馬海明.黃芩素固體脂質(zhì)納米粒包封率測(cè)定及體外釋放度考查. 實(shí)用藥物與臨床，2009，12(2)：104

7 謝方明，曾抗，李國(guó)鋒. 鬼臼毒素硬脂酸固體脂質(zhì)納米粒的制備.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(1)：99