侵襲性垂體腺瘤與非侵襲性垂體腺瘤的基因差異表達譜☆

張鈴鐺 霍鋼 肖文峰 杜安東 吳留洋 車朋余

垂體腺瘤約占顱內腫瘤的10%［1］，臨床上分為侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤，侵襲性垂體瘤手術治療困難，術后容易復發，患者預后差。侵襲性垂體腺瘤發病的確切機制尚未完全明確。本研究應用14 500條全長基因的PCR產物為靶基因制成寡聚核苷酸基因表達譜芯片篩選侵襲性垂體腺瘤與非侵襲性垂體腺瘤差異表達基因，分析與侵襲性垂體腺瘤發病相關的可能基因，結合相關生物信息學方法，基于全基因組水平對侵襲性垂體腺瘤與非侵襲性垂體腺瘤發生發展的相關基因進行篩選和分析，為探索侵襲性垂體腺瘤的發病機制提供研究方向和線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年3月至9月重慶醫科大學附屬第一醫院神經外科垂體腺瘤標本12例，其中男5例，女7例，年齡23～68歲，平均(43.3±0.4)歲。侵襲性垂體腺瘤與非侵襲性垂體腺瘤組織各6例，按侵襲性垂體腺瘤的判斷標準［2］，符合其中之一者即可確定為侵襲性垂體腺瘤，否則為非侵襲性垂體腺瘤。取得腫瘤組織迅速在生理鹽水中去除血漬，PBS緩沖液;沖洗后，錫箔包裹置液氮(－80℃)中保存。

1.2 基因芯片的制備及雜交 采用TRIzo1一步法分別提取侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤組織總RNA，并用RNeasy MiniKit(QIA·GEN)純化，1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計評價RNA的質量和完整性。打開RNA的二級結構，反轉錄合成第一鏈cDNA和合成cDNA第二鏈后再純化，體外轉錄合成aRNA并純化，單色熒光標記aRNA，純化單色熒光標記aRNA，42℃預熱封閉緩沖液，檢查芯片Human OneArrayTM(華聯公司，每一芯片上布放32050個探針，包含30968個基因探針和1082個實驗控制探針，上海生物芯片有限公司提供)的完整性，芯片緩緩的放入預雜交管內，42℃烘箱預雜交60 min，離心1 min甩干芯片上的水，掃描備用，將封閉后的芯片進行熒光掃描，目的是為了檢驗及確認芯片的品質。片段化aRNA置于室溫避光備用。芯片置于50℃雜交培養箱(Hybridization Incubator)旋轉架上，轉速設為約2 r/min、孵育16 h芯片洗脫，置于42℃搖床以轉速80 r/min搖動洗脫5min取出芯片，于洗液Ⅲ中上下移動漂洗十次。利用手掌式芯片離心機，去除芯片上的水份，將芯片置于黑色芯片盒中避光，準備掃描。

1.3 掃描和分析 芯片放Axon GenePix 4000B掃描儀上掃描，信號是掃描儀檢測出的光強度經過均一化后的數據，應用Gene-Pix軟件進行數據分析。均一化方法:將芯片所有探針組的熒光信號強度從小到大排序，去掉最大的2%和最小的2%后，將剩下探針組的平均信號值調整500。采用ImageViewer圖像處理軟件提取雜交信號疊加圖。侵襲性垂體腺瘤組和非侵襲性垂體腺瘤組對兩張芯片上對應探針的熒光信號強度比值的對數(signal logratio，SLR)≥2.00，認為該基因表達上調，SLR≤－2.00認為該基因表達下調。

1.4 逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)從抽提的總RNA中RNA樣品各1 μL進行反轉錄形成cDNA，再進行PCR。條件為95℃預變性5 min;95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，共35循環，最后72℃延伸10 min。實驗所用核酸酶抑制劑、AMV反轉錄酶和Taq酶均由上海生物芯片有限公司提供。選取芯片結果中上調表達的CDH12基因進行驗證，其上游引物5'TCTCTATTGATCCCAAGACAGGT3'，下 游 引 物 5'AATTTGATGACTCCCTCTTGTGT3'，擴增片段長308 bp;芯片結果中下調表達KLF4基因，上游引物5'CGCCTTGCTGATTGTCTATTT3'，下游引物 5'CCCAAAGTCAACGAAGAGAAG3'，擴增片段長度 171 bp，人GAPDH基因作為參照，上游引物5'ACCACAGTCCATGCCATAC3'，下游引物5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3'，擴增片段長500 bp。引物設計來自Genbank，由上海生物芯片有限公司合成。PCR產物用250 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 基因芯片的篩選結果以Signal Log Ratio值定為±2標準，用高通量基因表達譜芯片篩選。侵襲性垂體腺瘤組和非侵襲性垂體腺瘤組比較，篩選出差異表達基因153條，侵襲性垂體腺瘤組上調表達基因63條，下調表達基因90條?；蛐酒盘枓呙鑸D展示的是雜交完成的芯片在激光掃描儀下讀出的實際圖形如圖1、2(部分基因芯片信號掃描圖)，芯片采用的是生物素標記，單色熒光，激光掃描儀通過將光信號轉換成數字信號來獲得整張芯片每個點的信號。

2.2 Gene Ontology功能分析 153個差異表達基因主要分為7大功能組，見表1。表2和表3列出了上調表達和下調表達差異前10個基因及其相應功能以及基因公共數據庫號。

2.3 RT－PCR驗證結果上調基因CDH12和下調基因KLF4的驗證結果見圖3、4，結果證實目的基因A值比值與芯片結果變化趨勢一致，驗證了基因芯片結果的正確性。

3 討論

垂體腺瘤屬良性腫瘤，但由于部分垂體腺瘤可具有非良性腫瘤生長的特征，向鄰近組織浸潤生長而具侵襲性，腫瘤浸潤是決定腫瘤患者預后的一個重要因素。目前普遍認為腫瘤浸潤轉移是由多基因、多因素參與的過程。在我們的研究中發現侵襲性垂體腺瘤與非侵襲性垂體腺瘤存在明顯差異的基因表達，這些差異表達基因的作用機制目前尚不清楚。本研究利用人類全基因組芯片首次全面分析侵襲性垂體腺瘤與非侵襲性垂體腺瘤基因表達譜的差異，并對差異基因進行功能分析，從全基因組水平篩選和分析垂體腺瘤發生侵襲性的相關基因改變，這將對探索垂體腺瘤侵襲性發生發展的分子機制和治療提供幫助。

圖1 芯片雜交圖

圖2 芯片掃描圖

表1 差異表達基因的Gene Ontology功能分類

表2 侵襲性垂體腺瘤組上調表達基因差異的前10名基因

表3 侵襲性垂體腺瘤組下調表達基因差異的前10名基因

圖3 CDH12 mRNA在垂體腺瘤中的表達，1，2，3為非侵襲性垂體腺瘤，4，5，6為侵襲性垂體腺瘤，M為marker

用Gene Ontology功能分類標準對差異基因進行功能分析表明:差異表達基因13.3%與細胞結構有關，22.1% 與大分子代謝有關，25.0% 與信號傳導通路有關，19.6%與細胞生理過程調節有關，10.8%與免疫有關，1.2%與癌基因有關，8.0%功能未知。上調表達基因主要涉及癌基因、免疫調節相關基因、代謝相關基因、信號傳導等，下調表達基因主要涉及DNA結合、轉錄、免疫相關、信號傳導和傳遞蛋白等。

圖4 KLF4 mRNA在垂體腺瘤中的表達，1，2，3為侵襲性垂體腺瘤，4，5，6為非侵襲性垂體腺瘤，M為marker

本研究中，我們通過RT－PCR選取CDH12和KLF4兩個基因對基因芯片結果進行了驗證，驗證的結果提示基因芯片結果的可靠性。通過基因芯片篩選，我們發現某些基因的差異表達可能與垂體腺瘤侵襲性相關，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑E－1(serpin peptidase inhibitor，clade E，member 1，SERPINE1)編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，該家族抑制組織纖維蛋白溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)和尿激酶(urokinase ，uPA)。我們前期研究發現在侵襲性性垂體腺瘤中uPA的表達明顯高于非侵襲性垂體腺瘤組［3］，而N-cadherin12的高表達使MAPKERK信號轉導系統激活，從而誘導MMP-9(matrix metalloproteinases－9)基因表達，促進腫瘤血管的形成，使腫瘤易于生長和轉移［4］。在我們前期研究中也發現侵襲性垂體腺瘤中MMP－9表達明顯高于非侵襲性垂體腺瘤［5］。上述結果與Wierinckx A等［6］應用的cDNA芯片在侵襲性催乳素腺瘤中研究結果不一致，可能是基因芯片所含的信息量不同以及我們沒有將侵襲性垂體腺瘤及非侵襲性垂體腺瘤進行分型分別比較不同類型基因表達的差異。此次研究采用了信息容量更大DNA芯片研究并進行了RT-PCR驗證，發現了一些可能與侵襲性垂體腺瘤發病相關的新基因，但由于基因芯片篩查基因差異表達譜的樣本量較少，我們將在后續的實驗繼續進行驗證，探討它們與垂體腺瘤侵襲性相關的可能途徑。腫瘤侵襲性的發生由多基因、多分子、多步驟、多種因素參與的結果，對差異表達基因功能的進一步研究可以更好的揭示侵襲性垂體腺瘤發病機制，闡明多種基因如何在其發病中發揮作用，進而從基因水平上為侵襲性垂體腺瘤的診斷及治療提供幫助。

［1］魏俊吉，王任直.垂體腺瘤發病機制和臨床治療的研究進展［J］.中國神經精神疾病雜志，2009，35(2):121.

［2］馮清林，霍鋼，唐茂源，等.侵襲性垂體腺瘤中自噬相關基因Beclin-1和MAPLC3的表達［J］.中國神經精神疾病雜志，2010，36(8):476 －479.

［3］唐茂源，霍鋼，馮清林，等.uPA和uPAR在侵襲性垂體腺瘤中的表達及意義［J］.中國神經精神疾病雜志，2010，36(9):547－549.

［4］Lamora A，Voigt MM.Cranial sensory ganglia neurons require intrinsic N－cadherin function for guidance of afferent fibers to their final targets［J］.Neuroscience，2009，159(3):1175 – 1184.

［5］李九州，霍鋼，鄭履平，等.MMP－9、HPA及CD34在侵襲性垂體腺瘤中表達的研究［J］.中國神經精神疾病雜志，2007，33(7):404－407.

［6］Wierinckx A，Auger C，Devauchelle P，et al A diagnostic marker set for invasion，proliferation，and aggressiveness of prolactin pituitary tumors［J］.Endocrine － Related Cancer，2007，14(3):887 –900.