腦內血管緊張素肽酶活性不對稱性與大鼠行為偏側的相關性☆

常崇旺 吳鶴鳴 孫繼明 葛順楠 耿寧 王學廉

血管緊張素肽酶(angiotensinase)的一種亞型AT4具有類似半胱氨酸氨基肽酶(cystinyl－AP，CysAP)的特性，與血管緊張素IV(ANG IV)結合具有高特異性和親和力并參與記憶與認知加工［1－2］。海馬是大腦內調節學習和記憶功能的重要區域。研究表明左側海馬的膜性丙氨酰氨基肽酶(membrane bound alanylaminopeptidase，MEM－AlaAP)，可溶性半胱氨酸氨基肽酶(soluble bound cystinyl－aminopeptidase，SOL－CysAP)和膜性半胱氨酸氨基肽酶(membrane bound cystinyl－ aminopeptidase，MEM－CysAP)占主導地位［3］。這些結果使氨基肽酶與記憶的關系得到進一步確認。另有研究表明，強烈的右手偏利比沒有這種右手偏利被試的記憶力差［4］。這種偏側行為與記憶的關系是否有著海馬內氨基肽酶分布的內在聯系?為探討這一問題我們進行了如下實驗。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本實驗方案通過第四軍醫大學倫理委員會批準。60只成年雄性Wistar大鼠(200～250g)購于第四軍醫大學實驗動物中心。每5只安置于1個標準的聚丙烯籠子里。保持在12 h光線/12h(07:00～19:00)黑暗循環并給予充足的食物和水。

1.2 爪子偏好測試 爪子偏好測試根據Collins(1985)方法［5］進行了調整，大鼠入籠大概1周后實施爪子偏好實驗。在兩周內不同的日期測試4次，第一次為訓練期，根據其他3次的平均評分分組，右利評分(RPE)≥29分，入右利爪(RH)組;若RPE≤21分，入左利爪(LH)組;若RPE在21至29之間則分入雙利爪(L/R)組［4，6－7］。60 只大鼠經過測試后，RH 為36 只，LH 為8 只，L/R為16只。從以上3組大鼠中各隨機抽取6只大鼠進行了RPE的行為學試驗。

1.3 酶提取和測定 上述RPE行為學試驗的3組大鼠進行了酶提取和測定測試。組織樣本采集根據Banegal等人(2005)的研究設計［3］進行。RPE實驗結束1周后，在equithensin麻醉下，通過左心室給大鼠腦內注入鹽水(2 mL/kg)，將左右海馬的腦組織在干冰保護下解剖并快速取走(＜60 s)，并將左右海馬組織分別勻漿化后再分別放入相同體積的10 mmol/L鹽酸三羥甲基氨基甲烷(HCL－Tris)緩沖液中(PH=7.4)，并分別超高速離心(10000 r/min，30 min，4℃)后將離心液上層的液體取出用于測定膜性丙氨酰氨基肽酶(soluble bound alanyl－aminopeptidase，SOL－AlaAP)/SOL－CysAP 和 MEM－AlaAP/CysAP 的活性和蛋白質含量。酶測定方法根據Banegal等人(2005)的研究設計［3］進行。以β酰胺基萘酰胺為底物用熒光分析法測定AlaAP和CysAP水平(一式三份)［8－9］。每份上清液在底物溶液中25℃恒溫孵育30 min，加入醋酸鹽緩沖液(1mL，0.1mol/L，PH=4.2)終止反應。在酶的作用下β萘酰胺被釋放出來，用熒光分析測量412nm(發射波長)和345nm(激發波長)。利用BSA標準法測蛋白定量(一式三份)［10］。以每分鐘每毫克蛋白來表達特定可溶的或膜性AT4的活性，熒光分析與水解時間和蛋白質含量線性相關［3］。

1.4 被動逃避行為測試 從3組不同用爪偏好的大鼠中各隨機選出8只大鼠(左利爪為全組大鼠)，共24只大鼠進行了被動逃避行為測試。試驗的盒子包括一個亮室和一個暗室，由中間靠下的一個滑動門分開，第一天將大鼠放入亮室面對暗室，使其適應5 min后，將中間的擋板去掉，大鼠可以進入暗室，若大鼠的四只爪子都進入暗室，即通過暗室地板對其進行電刺激，電流0.3 mA，30 V，持續時間2 s，間隔2 s，循環5次。在此過程中大鼠均可進入亮室以逃避負性刺激。第二天的基礎過程與第一天一樣，并記錄第一次從亮室進入暗室的潛伏期，定義為“記憶維持(memory retention)”。大鼠進入暗室所用時間記錄為“進入時間(entrance)”。如果大鼠在10s電刺激內不離開暗室，則將大鼠取出，如果大鼠沒有在5min內進入暗室，則認定潛伏期為300 s。

1.5 統計分析 采用SPSS13.0進行統計分析。通過以下公式計算右側支配率(%R/T)=右半球/(右半球+左半球)×100%。采用單因素方差分析，雙因素方差分析，鄧肯檢驗(Duncan Test)，配對t檢驗和Pearson’s相關性分析來進行組間及組內數據的差異分析及相關性分析。檢測水準α=0.05。

2 結果

2.1 爪子偏好試驗的行為結果LH，R/L，RH 3組大鼠，每組各6只，LH組的RPE均數為12.2±1.2，R/L組的RPE均數為25.2±0.8，RH組的RPE均數為35.8±1.5。經鄧肯檢驗3組之間差異有統計學意義(P＜0.01);左爪偏好與右爪偏好差異有統計學意義(P＜0.05)。3組大鼠RPE單向方差分析顯示了行為偏側化的顯著效應 (F=616.748，P＜0.05)。

2.2 大鼠左右海馬的AlaAP/CysAP活性 進行了右利爪行為測試的大鼠進行了酶提取和測定試驗。這里顯示的是不考慮行為偏側化條件下的所有老鼠左側和右側海馬的AlaAP/CysAP的活性。如表 1示，左側海馬的 SOL－AlaAP/CysAP和 MEMAlaAP/CysAP活性較右側高(P＜0.05)。

2.3 不同用爪偏好大鼠左右海馬的AlaAP/CysAP的活性 見表2。3組大鼠左側海馬的SOL－CysAP和MEM－AlaAP/CysAP活性均較右側高(P＜0.05)。行為偏側化與左右側海馬氨基肽酶活性的相互作用僅僅在 SOL－CysAP［F(2，30)=46.606，P ＜0.05］和 MEM－CysAP［F(2，30)=3.762，P ＜0.05］是有統計學意義的。個體組間比較揭示L/R大鼠左側海馬的SOL－AlaAP活性比RH或者LH的大鼠高(P＜0.05)，MEM－AlaAP的活性比RH大鼠高(P＜0.05)。LH大鼠左側海馬SOL－CysAP和MEM－CysAP活性較L/R大鼠或RH大鼠高(P＜0.05)。L/R大鼠右側海馬SOL－AlaAP/Cy－sAP和 MEM－AlaAP/CysAP活性較 LH 或 RH 大鼠高(P＜0.05)。

表1 實驗組大鼠左右側海馬的SOL-AlaAP/CysAP和MEM-AlaAP/CysAP活性及差異檢驗(n=18)nmol/(min.mg)

表2 不同爪偏好大鼠左右側海馬的SOL-AlaAP/CysAP和MEM-AlaAP/CysAP活性及差異檢驗nmol/(min.mg)

2.4 大鼠海馬CysAP/AlaAP的%R/T活性 行為偏側化對海馬區 SOL－AlaAP［F(2，17)=0.105］的活性沒有影響(P ＞0.05)(圖1)，而對 MEM－AlaAP［F(2，17)=18.151，P ＜0.05］的%R/T活性具有影響。兩組間的個體比較顯示L/R大鼠MEM－AlaAP和SOL－CysAP的活性高于RH和LH的大鼠(P＜0.05)。L/R老鼠的 MEM－AlaAP［F(2，17)=18.151，P ＜0.05］的%R/T 活性也高于RH和LH的大鼠(P＜0.05)。

2.5 大鼠個體之間CysAP/AlaAP活性的%R/T及RPE分數的相關性 SOL－AlaAP和MEM－AlaAP和RPE評分的相關沒有統計學意義。而 RPE 評分與 SOL－CysAP［F(r= －0.904，n=18，P ＜0.05)和 MEM－CysAP［F(r= －0.500，n=18，P ＜0.05)成一種負相關關系。表明行為選擇和半球不對稱性與大鼠海馬區內CysAP的活性密切相關。

2.6 大鼠被動逃避行為測試的結果被動逃避行為測試的結果顯示(圖2)，分組對大鼠進入暗室的潛伏期的影響不顯著。但是在各組之間對照顯示LH的大鼠進入暗室的潛伏期顯著高于RH的大鼠(P＜0.05)。

3 討論

圖1 左爪偏好(LH)、雙爪偏好(L/R)及右爪偏好(RH)大鼠優勢半球的 R/T及 SOL－AlaAP/CysAP和 MEM－AlaAP/CysAP活性比較(n=18)。柱形圖上的垂直線表示標準差異，*表示P＜0.05(經鄧肯檢驗)

本研究的目的是發現行為偏側化與大腦內血管緊張素酶AlaAP和CysAp(特別是CysAp，即AT4)活性的關系。我們的數據提示AT4的活性與個體優勢爪的評分成一種負相關關系。

AT4 以優先結合 ANGIV 為特點［1，11－12］，這種 ANG IV/AT4 系統在與認知和記憶過程相聯系的大腦結構中非常重要:首先，研究發現大鼠、豚鼠和猴子的海馬內均具有AT4受體高密度分布的區域，而海馬區與記憶密切相關［13－14］。其次，有報告指出腦室內注射ANGIV可以影響海馬功能，因為這可以選擇性激活海馬區內錐體細胞和顆粒細胞的c－Fos免疫應答反應［15－16］。第三，對抗AT4受體可以破壞大鼠聯合與空間記憶的維持而ANGIV可以易化這些過程［11］。這些結果強烈提示海馬區血管緊張素酶(AlaAP和CysAp)在學習和記憶的調節過程中有重要作用。

圖2 左爪偏好(LH)、雙爪偏好(L/R)及右爪偏好(RH)大鼠的被動逃避行為測試結果(n=24)。時間(秒，s)表示大鼠進入暗室的時間及進入暗室的潛伏期的時間。柱形圖上的垂直線表示標準差異，*表示P＜0.05(經鄧肯檢驗)。

然而AT4受體的本身和其配體調節其反應的機制迄今仍不明確［1］。我們發現左側海馬區有較高的AlaAP和CysAP活性水平，提示相對重要的功能分布于左側。典型的大腦偏側優勢與左腦的語言優勢相聯系，在此研究擁有較高水平AT4活性的左側海馬在易化學習和記憶中可能比右側海馬更為重要。AT4成分與大腦偏側化相聯系。我們一般的認為LH大鼠有右腦優勢，RH大鼠有左腦優勢，此研究發現LH大鼠相比于RH大鼠在左側的海馬區內有較高的CysAP水平。但并沒有在LH大鼠和RH大鼠右側海馬發現顯著差異。

用優勢爪實驗研究偏側化可使偏側化研究量化和客觀。此研究揭示海馬活性半球優勢同側水平的優勢爪之間的關系。第一次顯示了AT4活性左右側海馬的差異性與個體RPE評分的線性負相關性。即AT4活性的左右側差異越大則個體的RPE評分越低，LH大鼠的AT4活性的左右側差異最大。

被動逃避行為是測試長期記憶的一個指標。在此研究中，LH大鼠表現出來的記憶維持時程長于RH大鼠，根據行為偏側化條件下AlaAP和CysAP活性總的結果，我們認為LH大鼠的AT4活性更高而且表現的腦記憶功能更優秀。

左側海馬區較右側海馬區AlaAP和CysAP的活性水平高，同時CysAP活性的不對稱與大鼠行為的方向和強度密切相關。我們僅僅初步了解了AT4活性到優勢爪通路的現象，對其可能的作用、效應等需后續研究進一步證實。

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